[发明专利]一种用于定位隐孢子虫胞内不同寄生时期特异表达蛋白的免疫电镜样品的制备方法

权利要求书

1.一种用于定位隐孢子虫胞内不同寄生时期特异表达蛋白的免疫电镜样品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）以HCT-8细胞作为感染细胞，接种经脱囊处理的隐孢子虫卵囊，进行细胞培养；

（2）在培养好的细胞中加入戊二醛-多聚甲醛混合固定液，进行固定；

（3）在固定好的细胞样本中加入低熔点琼脂糖，混合均匀，进行预包埋；

（4）离心收集细胞样本，冷却处理，切块，漂洗；

（5）用乙醇对漂洗好的块状细胞样本进行梯度脱水，再用LR-White树脂进行梯度渗透、包埋和聚合；

（6）将步骤（5）所得的细胞样本切片，将所得切片进行免疫金标记，再用重金属染色，即得到所述的免疫电镜样品；

步骤（2）中所述的戊二醛-多聚甲醛混合固定液是0.1%戊二醛-4%多聚甲醛混合固定液；

步骤（2）的具体操作为：于3～5℃条件下，先固定1～2h，成片刮起，转移至新管中，再继续固定至总固定时间为4～5h，然后弃掉固定液；

步骤（3）中所述的低熔点琼脂糖是温度为38～42℃、质量浓度为1.5%的低熔点琼脂糖溶液

步骤（4）中所述的离心的条件为温度23～27℃、转速5000～7000 rpm、时间3～5分钟；

在步骤（4）中所述的离心前，离心机的转子经37～42℃预热处理；

步骤（4）中所述的冷却处理的条件是温度2～4℃、时间8～12分钟；

步骤（5）中所述的梯度脱水的条件为：10%乙醇 4℃脱水30分钟、20%乙醇 4℃脱水30分钟、30%乙醇 4℃脱水30分钟、50%乙醇 4℃脱水1小时、70%乙醇 -20℃脱水1小时、80%乙醇-20℃脱水1小时、90%乙醇 -20℃脱水1小时、100%乙醇 -20℃脱水1小时、100%乙醇 -20℃脱水1小时；

步骤（5）中所述的梯度渗透的条件为：按体积比计，无水乙醇：LR-White树脂=3∶1 -20℃渗透2小时、无水乙醇：LR-White树脂=1∶1 -20℃渗透2小时、无水乙醇：LR-White树脂=1∶3 -20℃渗透2小时，换新的LR-White树脂 -20℃渗透过夜，换新的LR-White树脂 -20℃渗透24小时；

步骤（5）中所述的聚合的条件为在-25℃～-80℃、波长315～370nm的紫外光下聚合3～4天。

2.根据权利要求1中所述的用于定位隐孢子虫胞内不同寄生时期特异表达蛋白的免疫电镜样品的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的接种的时间为HCT-8细胞的细胞密度为60%～80%时；

步骤（1）中所述的隐孢子虫卵囊接种量按12孔板每孔接种1×10⁶～2×10⁶个卵囊/孔计算；

步骤（1）中所述的脱囊处理所用的脱囊液是浓度为0.4～0.6%w/v的次氯酸钠；

步骤（1）中所述的脱囊处理的条件为冰上处理8～12min。

3.根据权利要求2中所述的用于定位隐孢子虫胞内不同寄生时期特异表达蛋白的免疫电镜样品的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的接种的时间为HCT-8细胞的细胞密度为70%～80%时；

步骤（1）中所述的隐孢子虫卵囊接种量按12孔板每孔接种1×10⁶个卵囊/孔计算；

步骤（1）中所述的脱囊处理所用的是浓度为0.5%w/v的次氯酸钠；

步骤（1）中所述的脱囊处理的条件为冰上处理10min。

4.根据权利要求1中所述的用于定位隐孢子虫胞内不同寄生时期特异表达蛋白的免疫电镜样品的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的细胞培养的具体操作为：先培养2～3h，弃去未入侵的微小隐孢子虫卵囊，用磷酸盐缓冲盐水漂洗，加入新的培养基，继续培养至总培养时间为24～48h，然后弃去培养基，用磷酸盐缓冲盐水漂洗；

步骤（1）中所述的细胞培养培养所用的培养基为含有2%w/v胎牛血清的1640培养基。