[发明专利]一种用于定位隐孢子虫胞内不同寄生时期特异表达蛋白的免疫电镜样品的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于定位隐孢子虫胞内不同寄生时期特异表达蛋白的免疫电镜样品的制备方法。本发明将感染有隐孢子虫卵囊的HCT‑8细胞样品在戊二醛‑多聚甲醛混合固定液中固定，然后经低熔点琼脂糖预包埋，乙醇梯度脱水，LR‑White树脂渗透，包埋，聚合，将样品包埋块超薄切片后进行免疫金标记和重金属染色，即可制得电镜观察用的隐孢子虫样本。通过本发明方法，制备的样品的反应免疫原性良好，隐孢子虫形态良好，结构完整，隐孢子虫的纳虫空泡边缘光滑，可以看清胞内时期的隐孢子虫内部结构的样品，能够为研究胞内寄生时期的隐孢子虫的形态及虫体蛋白的定位，有利于研究隐孢子虫的入侵机制、代谢通路、致病机制，为开发疫苗提供可能。

技术领域

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种用于定位隐孢子虫胞内不同寄生时期特异表达蛋白的免疫电镜样品的制备方法。

背景技术

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种重要的水源性和食源性的传播病原，该病原进入人体内后主要引起以腹泻为主的隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)，尤其在儿童和免疫缺陷病病人中常会造成持续性腹泻。隐孢子虫是一种肠道寄生虫，被认为是继轮状病毒之后引起儿童腹泻和死亡的第二大诱因。并且它还是一种高度寄生的生物，复杂的生活史分为多个生活阶段，在宿主体内寄生时包括无性繁殖和有性繁殖阶段，传播时是以卵囊的形式排出体外。因此，研究隐孢子虫的同一个蛋白在不同生活阶段的的表达量，及不同虫种的同一个蛋白的表达量和胞内的亚细胞结构定位，可能为研究隐孢子虫的代谢通路和致病机制及开发疫苗提供可能。尽管关于隐孢子虫的研究取得了一定的进展，但仍然存在很多的未知有待探索。另外越来越多的证据表明，隐孢子虫病的发生具有全球性，特别是在免疫力低下或营养不良的儿童和人群中，并且全球许多中心研究的结果表明隐孢子虫感染与亚急性死亡率之间存在关联。但是现在需要更多的研究来阐明隐孢子虫感染的损伤机理和由此产生的健康影响。如何解释多种肠道病原导致儿童腹泻的原因也尚不清楚。隐孢子虫病药物的开发存在许多障碍，包括这些生物体外繁殖的困难。新的体外繁殖方法可以促进传播，也可以改善新疗法和疫苗在体外的筛选。150种用于药物评估的动物模型标准化程度不高，与人的功效相关的目标反应的特征也很差。因此，隐孢子虫胞内生活阶段的研究对深入认识隐孢子虫的生命活动的奥秘具有重要的意义。

透射电子显微镜观察胞内生活阶段的隐孢子虫的免疫样品需要克服以下技术难题，首先保证隐孢子虫生物膜和内部的结构完整以及接近天然状态的形态。次之，隐孢子虫和细胞的免疫原性保持良好，样品能具有良好抗原抗体反应。再者，可以尽可能看清的胞内时期的隐孢子虫的内部结构以便区分不同生活阶段。最后，可以使在体内寄生的不同生活阶段隐孢子虫尽可能的多样。这种使用化学的方法制备免疫样品及进行透射电子显微镜观察的技术就是免疫电镜技术。与其他的细胞生物学、结构生物学的研究方法相比，免疫电子显微成像技术对样品的需求量非常多，这与射线晶体学和核磁共振波谱学对样品的大量需求相比拟。

免疫电子显微镜是一种将抗原抗体反应的特异性和电子显微镜的高分辨率相结合的在亚细胞和超微结构水平上对抗原进行定位分析的一种高精确度、灵敏的技术。该技术主要用于病毒、细菌等微生物抗原定位、免疫性疾病的发病机理及超微结构免疫细胞化学研究等。免疫电镜技术成功的关键是：对细胞超微结构的完好保存；保证被检细胞或其亚细胞结构的抗原在原位，其抗原性不受损失；选择的免疫试剂能顺利穿透组织细胞结构与抗原结合。所以在这里，该免疫电镜样品的制备方法是在普通透射电镜的方法上进行改进的，为了研究隐孢子虫入侵机制提供一定研究手段。因此，隐孢子虫免疫电子显微镜的样品制备是整个过程中的关键步骤，隐孢子虫的形态要保存完好，并且其抗原性良好。这样对样品进行切片观察时，隐孢子虫的有完整的形态可以被观察识别出来，经过抗体孵育及重金属染色后，抗体可以和相应的隐孢子虫的抗原准确的结合并且精确的定位隐孢子虫的相应内部结构上。必须在样品制备这一步骤取得重要的突破。

发明内容