[发明专利]一种双酶发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法

权利要求书

1.一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，25～37℃、200～250 rpm下培养10～18h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照0.5%～15%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为150～400rpm，通气比为0.1～1.5V/V.min，25～37℃温度下培养5～16 h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～10%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为100～1000 rpm，通气比为0.2～2 V/V.min，25～37℃温度下，控制pH为6.6～8.5，培养20～40小时，发酵结束得到发酵液；

（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD₆₀₀值达到20～100时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制其浓度为0.1～1.5 mmol/L；

（5）将步骤（4）所得的发酵液进行压滤得到大肠杆菌菌体，进行重悬10～20min，0.1～0.5Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液、压滤得到粗酶液；

（6）催化体系：将甜菊糖苷、尿苷二磷酸、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比40-100 ：1-4：400-600：50-100混合，随后在25-40℃下反应时间24-48 h即可得莱鲍迪苷A。

2.根据权利要求1所述一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：步骤（1）中LB培养基优选温度为30～36 ℃，转速220～235 rpm，培养时间为13～15 h。

3.根据权利要求1所述一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：步骤（2）中种子罐优选转速为220～350 rpm，通气比为0.5～1 V/V.min，在30～36 ℃温度下培养8～10 h。

4.根据权利要求1所述一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：步骤（3）中发酵罐优选转速为450～780 rpm，通气比为0.5～1.5 V/V.min，在30～36 ℃温度下，控制pH为7～8，培养25～35 h。

5.根据权利要求1所述一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：步骤（4）中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度优选为0.5～1 mmol/L。

6.根据权利要求1-5任一项所述一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：所述步骤（3）中发酵培养基制备方法如下：按照磷酸二氢钾2～10 g、磷酸氢二铵1～10g、柠檬酸0.5～9 g、酵母粉2～20 g、葡萄糖5～50 g、微量元素母液1～20 g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为6.6～8.5，用去离子水定容至1000 ml。

7.根据权利要求6所述一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：所述微量元素母液制备方法如下：按照EDTA-2Na 0.84g、六水氯化钴0.25 g、四水氯化锰1.5 g、五水硫酸铜0.22 g、硼酸0.3 g、钼酸铵0.182 g、硫酸锌1.7 g、柠檬酸铁铵13.75 g 、浓硫酸5滴的比例去配制，用去离子水定容至1000 ml。