[发明专利]一种双酶发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法

说明书

本发明涉及一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：（1）糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，25～37℃、200～250 rpm培养10～18h；（2）按0.5%～15%接种量接到种子罐，150～400rpm，通气比0.1～1.5V/V.min，25～37℃培养5～16 h；（3）按1%～10%接种量接入发酵罐，100～1000 rpm，通气比0.2～2 V/V.min，pH 6.6～8.5，25～37℃培养20～40h；（4）OD₆₀₀值达20～100时加诱导剂，浓度0.1～1.5 mmol/L；（5）发酵液压滤、重悬、破碎、压滤得粗酶液；（6）甜菊糖苷、尿苷二磷酸、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比40‑100：1‑4：400‑600：50‑100混合，25‑40℃反应24‑48 h即可。本发明优点：一次发酵获得两种粗酶液，操作步骤少；酶活性高，生产成本低。

技术领域

本发明属于微生物发酵酶制剂技术领域，涉及一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法。

背景技术

甜菊糖（甜菊糖苷）是从甜叶菊干叶中提取的天然甜味剂，其甜度是蔗糖的200～300倍，有一定程度的薄荷醇味，后苦味较为明显，整体的甜味口感不是很好。甜叶菊中的甜菊苷成分占糖苷总量的 60%～70%，是苦味的主要来源；莱鲍迪苷A约占糖苷总量的 15%～20%，口感优于甜菊苷，更接近于蔗糖，同时具有更高的稳定性和安全性。

目前甜菊糖微生物发酵法研究较少，植物提取分离甜菊苷和莱鲍迪苷A成本较高，甜菊糖产业发展较为缓慢。随着对甜味剂口感要求的提高，对莱鲍迪苷A等高端产品的需求越来越大。甜叶菊糖基转移酶能将甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，现有的酶催化技术在催化底物过程中需添加尿苷二磷酸葡萄糖作为原料，尿苷二磷酸葡萄糖市场价格高昂，导致成本较高，工业化生产受到一定限制。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有莱鲍迪苷A生产成本高、酶活性低的问题，提供一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，25～37℃、200～250 rpm下培养10～18h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照0.5%～15%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为150～400rpm，通气比为0.1～1.5V/V.min，25～37℃温度下培养5～16 h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～10%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为100～1000 rpm，通气比为0.2～2 V/V.min，25～37℃温度下，控制pH为6.6～8.5，培养20～40小时，发酵结束得到发酵液；

（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD₆₀₀值达到20～100时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制其浓度为0.1～1.5 mmol/L；

（5）将步骤（4）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到大肠杆菌菌体，随后大肠杆菌进行重悬10～20min，0.1～0.5Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（6）催化体系：将甜菊糖苷、尿苷二磷酸、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比40-100 ：1-4：400-600 ：50-100 混合，随后在25-40℃下反应时间24-48 h即可得莱鲍迪苷A。