[发明专利]一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法

说明书

本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：1.糖基转移酶UGT76G1基因连接到PBR322质粒载体上，将质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将枯草芽孢杆菌接入LB培养基，30～37℃培养20～24 h；2.按1%～10%体积比的接种量接入种子罐中培养，通气，30～37℃培养20～24 h；3.按1%～10%体积比的接种量接入发酵罐中培养，通气，控制pH为6～8，30～37℃培养48～72h；4.压滤得到枯草芽孢杆菌菌体，重悬，高压均质破碎，压滤得粗酶液；5.将甜菊糖苷、尿苷二磷酸葡萄糖、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比5‑10：1‑5：40‑60：5‑20混合，在25‑40℃反应12‑48 h即可。本发明优点：提高了莱鲍迪苷A的产量，可达85.3 g/L；操作步骤少，生产成低本，易于工业化生产。

技术领域

本发明属微生物发酵酶制剂技术领域，涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法。

背景技术

甜菊糖（甜菊糖苷）是从甜叶菊干叶中提取的天然甜味剂，其甜度是蔗糖的200～300倍，能量约为蔗糖的1/300，无毒无副作用，具有较高的稳定性和安全性，是代替蔗糖理想的天然甜味剂，被国际上誉为“第三糖源”。有研究报道，长期食用甜菊糖可以预防高血压、糖尿病、肥胖病、蛀齿等疾病。甜菊苷占糖苷总量的60% ～ 70%，其口感差于莱鲍迪苷A，有一定的后苦味。莱鲍迪苷A是甜菊糖苷混合物中的一种糖苷成分，是甜菊糖苷成分中甜度最高的，口感最接近蔗糖，具有更高的稳定性。

目前，有报道利用酶法和发酵法对甜菊糖进行改质，专利公开号为CN108486160A中报道了一种高密度发酵法合成莱鲍迪苷A的方法，但其发酵液中的成分复杂，且甜菊糖产量低，分离成本高；全细胞催化效率低，需要大量的细胞菌体进行催化，成本高，难以工业化生产。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有酶法和发酵法将甜菊苷催化为莱鲍迪苷A的生产中存在的生产成本高，操作复杂，不能应用于工业化生产的问题，提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）种子制备：将已合成的糖基转移酶UGT76G1基因连接到PBR322质粒载体上，将载有基转移酶UGT76G1基因的PBR322质粒载体导转到枯草芽孢杆菌的感受态中，将植入了糖基转移酶UGT76G1基因的枯草芽孢杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度30～37 ℃，转速100-250 rpm，培养时间20～24 h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得的枯草芽孢杆菌按照1%～10%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为200～400 rpm，通气比为0.1～1 V/V.min，30～37℃温度下培养20～24 h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～10%体积比的接种量，接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为200～1000 rpm，通气比为0.1～2 V/V.min，在30～37℃温度下，控制pH为6～8，培养48～72小时，发酵结束得到发酵液；

（4）将步骤（3）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到枯草芽孢杆菌菌体，随后对枯草芽孢杆菌菌体进行重悬10～20min，0.1～0.5Mp下高压均质破碎得到枯草芽孢杆菌菌体破碎液，随后将枯草芽孢杆菌菌体破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（5）催化体系：将甜菊糖苷、尿苷二磷酸葡萄糖、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比5-10 ：1-5：40-60 ：5-20 混合，随后在25-40℃下反应时间12-48 h即可得莱鲍迪苷A。