[发明专利]基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法及应用

权利要求书

1.一种基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法，其特征在于，所述基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法包括：

第一步，将甲基苯丙胺腹腔注射构建的帕金森小鼠使用由氨苄青霉素1g/L、甲硝唑1g/L、三硫酸新霉素1g/L和万古霉素1g/L组成的抗生素混合物对小鼠进行喂食；

第二步，喂食方式为每日3次，持续一周，在喂食抗生素期间小鼠的食物和饮水通过杀菌处理。

2.如权利要求1所述的基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法，其特征在于，所述第一步将甲基苯丙胺腹腔注射构建的帕金森小鼠使用由氨苄青霉素1g/L、甲硝唑1g/L、三硫酸新霉素1g/L和万古霉素1g/L组成的抗生素混合物对小鼠进行喂食。

3.如权利要求1所述的基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法，其特征在于，所述第二步喂食方式为每日3次，持续一周，在喂食抗生素期间小鼠的食物和饮水通过杀菌处理。

4.如权利要求1所述的基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法，其特征在于，所述基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法的甲基苯丙胺诱导帕金森小鼠模型的构建包括：40只体重20-26g、年龄6-8周的成年雄性C57BL/6J小鼠；成年小鼠被分开关在笼子里，温度控制在22℃，每天进行12小时的黑暗/光照交替处理，并提供充足的食物和水；将小鼠随机分为两组，每组20只。

5.如权利要求4所述的基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法，其特征在于，

1)腹腔注射生理盐水对照组，每天注射2次，每次注射量为15mg/kg体重，每次注射间隔12h，共注射8次；

2)甲基苯丙胺腹腔注射组，每天注射2次，每次注射量为15mg/kg体重，每次注射间隔12h，共注射8次；

将两组动物进行运动协调性检测，再每组中随机选取5只小鼠做脑组织的Westernblot检测和酶联免疫吸附法检测。

6.如权利要求2所述的基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法，其特征在于，所述基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法还包括：对小鼠进行运动协调性检测，将转棒的的速度从4转调到40转，将所有小鼠在旋转装置中预培训以达到稳定的行为，记录小鼠停留在旋转杆上的时间，重复3次。

7.如权利要求2所述的基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法，其特征在于，所述基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法还包括：小鼠脑组织的Westernblot检测，从实验组和对照组中随机抽取5只小鼠，将小鼠麻醉后处死，用4％多聚甲醛固定，切除大脑，切除前额叶皮质、海马和中脑区域；每个样品在液氮上快速冷冻，并保持在-80℃下；将脑组织切片在无菌冰冷磷酸盐缓冲液中洗涤两次，用蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂在RIPA裂解缓冲液中裂解，蛋白质浓度用双辛酸蛋白质测定法测定，在浓度为12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上变性，将每个裂解液中相同量的蛋白质分离，并转移到聚偏氟乙烯膜上；在5％牛血清白蛋白、TIS缓冲液和TWEN-20缓冲液中室温孵育1小时，然后与初级抗体在4℃下过夜，用TrIs缓冲盐TWEN-20将膜洗涤三次，并与过氧化物酶结合的二级抗体在室温下孵育1小时，按照以上方法清洗膜，然后使用化学发光试剂进行检测，用Gel-Pro分析仪对带强度的信号进行量化。

8.如权利要求2所述的基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法，其特征在于，所述基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法还包括：酶联免疫吸附法检测小鼠脑组织多巴胺，收集小鼠脑组织，用微量双氰胺酸试剂盒测定蛋白质浓度，使用ELISA试剂盒检测多巴胺水平，用微型读板器读取450nm处的吸光值，用标准曲线测定样品浓度。

9.一种由权利要求1～8任意一项所述基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型构建方法的基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型。

10.一种如权利要求9所述基于甲基苯丙胺诱导帕金森无菌小鼠模型在治疗帕金森药物制备中的应用。