[发明专利]测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法

说明书

本发明公开了一种测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法。所述方法包括下述步骤：供试品溶液制备：利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠复合溶液进行酶解；标准品溶液制备：将盐酸赖氨酸标准品溶解得到；检测步骤：使用高效液相色谱法，利用在线衍生技术，检测所述的供试品溶液和标准品溶液，使用外标法确定盐酸赖氨酸的含量。本发明使用透明质酸酶对供试品进行前处理，并结合液相色谱分离技术测得供试品中盐酸赖氨酸含量，方法准确度高，检测限低。按照本发明的方法，能够避免交联透明质酸钠对盐酸赖氨酸含量测定的干扰，提高检测准确度，降低检测限。同时又能够减少交联透明质酸钠复合溶液对色谱柱的损耗，延长色谱柱使用寿命。

技术领域

本发明涉及氨基酸检测的技术领域，尤其涉及一种酶解法联合HPLC法测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronicacid，HA)是人和动物皮肤、玻璃体、关节润滑液和软骨组织的重要成分，一般为其钠盐，即透明质酸钠(Sodium hyaluronate,SH)，习惯上仍称为透明质酸。分子式为(C₁₄H₂₁NO₁₁)n，它由(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接而成，其聚合物在体内的分子量大小范围从5000至2000万道尔顿不等，被认为是一种填充空间、稳定结构、涂层细胞和保护细胞的多糖。

透明质酸被广泛使用在修复手术、眼部手术或作为美容产品填充皱纹。透明质酸具有良好的理化性能及生物相容性。然而，它在体内受到透明质酸酶的酶解作用而迅速降解，存留时间较短，需要重复注射才能达到疗效。交联透明质酸是透明质酸经交联剂交联修饰得到的具有三维立体结构的高分子凝胶，可以弥补透明质酸钠存留时间短等缺点，同时仍具有良好的生物相容性及效果。注射用透明质酸钠复合溶液并不是单纯的交联透明质酸钠，还含有盐酸赖氨酸，其可以辅助成纤维细胞合成胶原蛋白。

目前常用的氨基酸检测方法有电位滴定法、茚三酮显色法以及衍生化高效液相色谱法。例如中国专利申请号CN201910490795.1中公开了一种测定黄精红曲中游离氨基酸含量的方法，其使用的异硫氰酸苯酯为衍生化试剂，高效液相色谱法测定氨基酸含量，但是其衍生化步骤比较复杂，需要萃取处理，操作粗犷，影响含量测定结果。

发明内容

本发明人开发的方法中，利用邻苯二甲醛为衍生试剂，可使供试品在水溶液中与衍生化试剂直接反应，优化操作步骤，提高测定准确度。但是在衍生后检测盐酸赖氨酸含量时发现，注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸的含量测定结果与投料量偏差较大，重复性差，怀疑注射用透明质酸复合溶液中交联透明质酸钠的复杂结构影响盐酸赖氨酸含量的检测；而且由于注射用透明质酸钠复合溶液的黏性容易堵塞色谱柱，柱效降低，影响检测结果，同时缩短柱子使用寿命。

为了解决上述问题，本发明人对之前开发的方法、特别是供试品的前处理进行了优化，从而确定了酶解法联合使用高效液相色谱法测定注射用透明质酸复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，将注射用透明质酸钠复合溶液中交联透明质酸钠特异性酶解后，进行盐酸赖氨酸的衍生化反应，能够大大提高注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的准确度，检测限低至10^-4ppm，同时延长色谱柱的使用寿命，维持色谱柱柱效。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供了测定注射用透明质酸钠复合溶液中盐酸赖氨酸含量的方法，其包含下述步骤：

供试品溶液制备：利用透明质酸酶对注射用透明质酸钠复合溶液进行酶解；

标准品溶液制备：将盐酸赖氨酸标准品溶解得到；

检测步骤：使用高效液相色谱法，利用在线衍生技术，检测所述的供试品溶液和标准品溶液，使用外标法确定盐酸赖氨酸的含量。