[发明专利]用于细菌asd基因平衡致死系统的表达质粒及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于细菌asd基因平衡致死系统的表达质粒及其应用，表达质粒包含Trc启动子，多克隆位点，rrnB T1终止子，rrnB T2终止子，bom区域，ori复制起始位点，β内酰胺酶和asd基因；通过gfp基因扩增、pEASY‑blunt‑gfp构建、pCW1910‑gfp构建、HXΔasd菌株构建和pCW1910‑gfp转化HXΔasd菌株等步骤在减毒沙门菌中表达绿色荧光蛋白。本发明提供的表达质粒去除了抗性基因，解决了抗性基因在自然界基因漂移的问题，并且在减毒沙门菌中表达了绿色荧光蛋白。本发明的表达质粒适用于与细菌asd基因组合平衡致死系统。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种质粒载体，具体地说是一种用于细菌asd基因平衡致死系统的表达质粒及其应用。

背景技术

沙门菌是一种人兽共患病病原菌，是引起食源性疾病的常见病原体，可通过污染的禽肉、蛋制品导致人类感染，且感染率较高，可引起严重的公共卫生问题。沙门菌亦可感染不同种类、不同日龄的禽类，可引起急性或慢性传染病，对禽类养殖业造成巨大的经济损失。

沙门菌属侵袭性胞内菌，可将外源质粒DNA直接呈递给抗原递呈细胞(APC)，携带质粒DNA的细菌在APC细胞内发生溶解或以宿主吞噬小体进入胞质，并将DNA释放到细胞核，从而使抗原基因在体内进行表达，并诱导相应的细胞免疫和体液免疫反应，已被证明是携带外源基因的良好载体。

近年来，人们对通过基因工程技术使沙门菌的毒力减弱，进而将减毒沙门菌作为疫苗或疫苗活载体的途径愈发引起了人们的兴趣。沙门菌通过基因工程的方法减毒后，其对宿主的致病性大大降低，但仍可保留良好的侵袭力和免疫原性。因此，以减毒沙门菌为载体的疫苗进入机体后，仍能够入侵肠上皮细胞，并定居在肠道淋巴组织内，同时吞噬细胞不断摄取抗原，引起机体产生相应的免疫应答。

而目前人们利用减毒沙门菌制备疫苗的方法通常为：将编码某种蛋白的基因克隆到一些质粒载体上，然后将其转化入某种减毒沙门菌中，依此途径来获得外源基因的表达。但遗憾的是，此种方法获得的重组沙门氏菌中外源抗原表达量较低，且常常遇到的另一个问题是在体内外源基因表达的不稳定。同时，该种方法获得的重组减毒沙门菌往往采用了携带抗性基因的表达质粒，以期作为重组菌在体内生长的主要遗传标记。然而，由于抗性基因存在在自然界基因漂移的问题，而且近年来，出于生物安全的考虑，因此此类含有抗性选择系统的质粒已不再被人们所接受。

发明内容

本发明的目的，是要提供一种用于细菌asd基因平衡致死系统的表达质粒，去除了抗性基因，解决了抗性基因在自然界基因漂移；

本发明的另一个目的，是要提供上述用于细菌asd基因平衡致死系统的表达质粒的一种应用。

本发明为实现上述目的，所采用的技术方法如下：

一种用于细菌asd基因平衡致死系统的表达质粒为pCW1910质粒，包含Trc启动子，多克隆位点，rrnB T1终止子，rrnB T2终止子，bom区域，ori复制起始位点，β内酰胺酶和asd基因； pCW1910质粒的核苷酸序列为