[发明专利]2’-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种2'‑岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，属于代谢工程技术领域。本发明通过融合表达重组枯草芽孢杆菌BSGL‑FF中的岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因获得了可高效合成2’‑岩藻糖基乳糖的菌株，其发酵上清液中积累量高达1.62g/L，比对照菌株高了55％。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种2’-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术

母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。其中，母乳寡糖(Human Milk Oligosacchrides,HMOs)在许多生理功能上起到了关键的作用，例如促进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(FOSs)由于其生理功能如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和减少炎症的能力，已经获得了极大的关注。

在过去的几年中，人们开始通过微生物发酵生产2’-FL。在2012年，首先通过转化的大肠杆菌通过高细胞密度培养的分批补料发酵和全细胞生物合成来生产2’-FL，并通过LC/MS鉴定了微生物合成的2’-FL。并开始在大肠杆菌上进行代谢工程化策略，包括删除Lac操纵子修饰缺失GDP-L-岩藻糖下游基因wcaJ和lon基因(Lon蛋白酶降解正调控因子RcsA等)。首先选择了来自幽门螺杆菌26695的FucT2进行FucT2的生物合成。之后，四个从头途径基因，manB，manC，gmd和wcaG被过表达，并且回补途径也被引入到工程化大肠杆菌中。为了进一步提高从头和回补途径的2’-FL产量，有人敲除了基因fucI和fucK，并筛选了11个FucT2候选基因。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。但是现有的2’-FL合成枯草芽孢杆菌中的异源糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶表达水平较低，限制了重组枯草芽孢杆菌中2’-FL的合成。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过表达FKP(岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶)和FutC(岩藻糖基转移酶)融合蛋白，可以有效提高胞内岩藻糖基转移酶、岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶的表达，促进了2’-岩藻糖基乳糖的合成。

本发明的第一个目的是提供一种2’-岩藻糖基乳糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，所述的重组枯草芽孢杆菌是在枯草芽孢杆菌BSGL中过表达岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶(FKP)与岩藻糖基转移酶(FutC)的融合蛋白得到，其中，所述的枯草芽孢杆菌BSGL是通过在枯草芽孢杆菌168的基因组中强化表达乳糖运输酶基因得到。

进一步地，所述的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶(FKP)与岩藻糖基转移酶(FutC)之间通过linker连接。

进一步地，所述的linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.6所示。

本发明的枯草芽孢杆菌BSGL的构建方法参见专利201910093684.7中实施例1的构建方法，将P43启动子和乳糖运输酶基因替换枯草芽孢杆菌168的淀粉酶基因amyE位点，来强化表达枯草芽孢杆菌168的乳糖运输酶基因。所述乳糖运输酶基因如NCBI中Gene ID:949083所示。

本发明所述的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因来源于脆弱拟杆菌，岩藻糖基转移酶来源于幽门螺旋杆菌。

进一步地，所述的岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因的核苷酸序列如NCBI上GenBank:AY849806.1所示。

进一步地，所述的岩藻糖基转移酶的核苷酸序列如NCBI上GenBank:KY499613所示。