[发明专利]组成型分泌表达O型FMDV重组抗原表位基因工程CHO细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原的CHO细胞系的构建方法，其特征在于：在CHO细胞HPRT基因2号外显子，定点插入信号肽-HBcAg-OME2的基因；

所述信号肽-HBcAg-OME2的氨基酸序列如SEQ ID NO：02所示；

所述OME2的氨基酸序列如SEQ ID NO：01所示；

所述CHO细胞系的构建方法，包括以下步骤：

步骤一、构建打靶质粒：根据HPRT 2号外显子的基因序列设计sgRNA，将所述sgRNA与pSpCas9（BB）-2A-Puro载体连接构建打靶质粒，得到HPRT打靶质粒；

所述HPRT的sgRNA为H-2，其中：H-2：GTGGCCCTCTGTGTGCTGAA；

步骤二、构建供体质粒：根据打靶位点确定同源臂序列；将所述同源臂序列与信号肽-HBcAg-OME2基因序列相连，通过添加载体元件并插入PMD19-T载体构建供体质粒，由此得到HPRT供体质粒H-19T；

步骤三、瞬时转染供体质粒验证表达：将HPRT供体质粒转染CHO细胞，验证是否转染成功并表达目的蛋白；若转染成功并表达目的蛋白，继续进行下一步骤；

步骤四、共转染打靶质粒和供体质粒加压筛选阳性克隆：将供体质粒H-19T酶切线性化，得到线性化供体质粒H-19T；将步骤一所得HPRT打靶质粒与所述线性化供体质粒H-19T混合后得到混合物Ⅰ；将所述混合物Ⅰ转染CHO细胞，利用CSRISP/Cas9同源重组技术，使信号肽-HBcAg-OME2融合基因与CHO细胞基因组发生同源重组，经筛选获取阳性克隆，得到组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原的CHO细胞系；

步骤二所述HPRT供体质粒，是以CHO细胞HPRT基因2号外显子为打靶位点，选择所述打靶位点两侧各750 bp序列为同源臂序列，将所述同源臂序列与信号肽-HBcAg-OME2基因相连后插入载体所得。

2.如权利要求1所述的CHO细胞系的构建方法 ，其特征在于：步骤二所述添加载体元件是以PEF1α启动子启动信号肽-HBcAg-OME2基因、在信号肽-HBcAg-OME2后添加SV40 PolyA、以PCMV启动子启动筛选基因EGFP和PURO并在所述筛选基因后添加SV40 PolyA。