[发明专利]组成型分泌表达O型FMDV重组抗原表位基因工程CHO细胞系的构建方法

说明书

本发明涉及组成型分泌表达O型FMDV重组抗原表位基因工程CHO细胞系的构建方法，属于基因工程领域，以SCGB1D1 isoform信号肽和重新串联的OME2为元件，以HBcAg为骨架，设计信号肽‑HBcAg‑OME2融合基因，构建包含所述融合基因的供体质粒，利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带信号肽‑HBcAg‑OME2的融合基因整合到CHO细胞染色体的HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因和8号染色体端粒区，构建的基因工程CHO细胞能组成型分泌表达FMD重组抗原，为将来实现大量组成型分泌表达口蹄疫病毒重组抗原提供了技术平台和基因工程CHO细胞系，具有重要的经济价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种基因工程CHO细胞系的构建方法。

背景技术

HBcAg作为抗原表位展示载体，重组蛋白可自组装成天然病毒样颗粒(VLP)。因此，利用该HBcAg作为载体展示外源抗原表位，不仅可以使抗原表位展示在病毒样颗粒的表面，诱导体液免疫反应，而且可以通过激活模式识别受体(PRRS)激发固有免疫和细胞免疫反应。但原核(E.coli)系统表达的HBcAg外源蛋白常常是包涵体，不能折叠组装成天然病毒样颗粒，需要对包涵体变性溶解，复性等一系列的处理过程，实现重组蛋白的重新折叠组装。这种组装不仅过程复杂，而且组装过程受到缓冲系统，孵育时间，蛋白浓度、溶液离子强度、环境温度等条件的影响，VLP产量低，成本高，不适合大规模生产。因此，开发能可溶性表达，细胞内组装VLP的重组表达系统显得尤为重要。

CHO细胞作为目前生产各种医用治疗性生物制剂的最广泛的真核细胞表达系统(Renner et al.,1995)，不仅可以实现重组蛋白的可溶性表达，保证其天然结构，而且可以对表达蛋白进行修饰，最大化保证重组蛋白的生物学与免疫学功能。但是CHO细胞常常以瞬时形式表达重组蛋白，而且表达量低，导致生产成本非常高，用于生产医用生物制剂尚可，但不适宜生产兽用疫苗用重组抗原或生物试剂。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的一在于提供一种O型FMDV抗原表位基因OME2，目的二在于提供一种重组蛋白信号肽-HBcAg-OME2基因，目的三在于提供包含所述信号肽-HBcAg-OME2基因的重组载体，目的四在于提供分泌表达所述信号肽-HBcAg-OME2重组蛋白的基因工程CHO细胞系，目的五在于提供所述基因工程CHO细胞系的构建方法。利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将携带SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2的融合基因整合到CHO细胞染色体的HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因或8号染色体端粒区，构建携带SCGB1D1 isoform-HBcAg-OME2融合基因的基因工程CHO细胞，为实现组成型可持续表达重组蛋白奠定了基础。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一种O型FMDV重组抗原表位OME2，其特征在于：将PADRE T细胞淋巴表位命名为E4、将GenBank:AAK62010.1中O型口蹄疫VP1第135-160位氨基酸命令为E5、将GenBank:AF506822.2中O型口蹄疫VP1第200-213位氨基酸命名为E6、将GenBank:JN998085.1中O型口蹄疫VP1第135-160位氨基酸命名为E7；所述抗原表位基因OME2是将E4、E5、E6、E7和E6依次串联所得。

一种重组蛋白信号肽-HBcAg-OME2，是将SCGB1D1 isoform信号肽、HBcAg 1-78氨基酸段、所述的抗原表位基因OME2和HBcAg81-149氨基酸段依次串联所得。进一步地，在HBcAg 1-78氨基酸段N末端和HBcAg81-149氨基酸段C末端分别添加6×His标签。

一种重组载体，包含上述信号肽-HBcAg-OME2基因的核苷酸序列。