[发明专利]一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用

权利要求书

1.一种猪伪狂犬病病毒的致弱方法，所述方法包括：

(1)所述猪伪狂犬病病毒的适应培养步骤，将猪伪狂犬病病毒接种到哺乳动物传代细胞中，进行传代培养至所述猪伪狂犬病病毒传代5代以上，得到猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株；以及

(2)所述猪伪狂犬病病毒的致弱步骤，将所述步骤(1)的所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株接种到禽源传代细胞中，进行传代培养至所述猪伪狂犬病病毒传代1代以上，得到所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株。

2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(1)中的猪伪狂犬病病毒包括猪伪狂犬病病毒JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、PRV TJ株、猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01、猪伪狂犬病毒变异株HN1201株、猪伪狂犬病毒变异株HN1202株、猪伪狂犬病病毒Fa株。

3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(1)中的所述哺乳动物传代细胞包括猪睾丸传代细胞ST，猪肾传代细胞PK15或IBRS-2、兔肾传代细胞RK、非洲绿猴肾传代细胞vero、猴胚胎肾上皮传代细胞Marc-145、牛睾丸传代细胞BT或乳仓鼠肾传代细胞BHK-21。

4.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(2)中所述的禽源传代细胞为DF-1。

5.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(1)的猪伪狂犬病病毒的适应培养步骤包括：

所述哺乳动物传代细胞经胰酶进行细胞分散消化，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；以及

将所述猪伪狂犬病病毒接种至所述的传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；40h～48h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液作为继续传代用毒种，进行下一步的传代，所述传代传至5代以上，得到猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株。

6.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(2)的所述猪伪狂犬病病毒的致弱步骤包括：

所述禽源传代细胞经胰酶进行细胞分散消化，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；以及

将所述步骤(1)得到的所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物传代细胞适应株接种至所述的禽源传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；40h～48h后，收获细胞培养病毒液，即为猪伪狂犬病病毒弱毒株；或将所述收获的病毒液进行下一步的传代，所述传代传至1代以上，得到所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株。

7.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述步骤(1)中所述猪伪狂犬病病毒株在哺乳动物细胞上传代培养代数为≥18代；所述步骤(2)中所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株在禽源传代细胞进行传代的代数为≥3代；优选地，所述猪伪狂犬病病毒哺乳动物细胞适应株在禽源传代细胞进行传代的代数为3～110代。

8.根据权利要求5或6所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法，其中，所述细胞生长液含90％～97％体积百分比的细胞培养液和3％～10％体积比的牛血清，所述细胞生长液的pH值为7.0～8.0；

所述细胞维持液含95％～99％体积百分比的细胞培养液和1％～5％体积比的牛血清，所述细胞维持液的pH值为7.1～7.5；

所述细胞培养液包括MEM培养液、DMEM培养液、EMEM培养液、199培养液、1640培养液和α-MEM培养液，所述的牛血清包括胎牛血清、新生牛血清或小牛血清；优选的，所述的细胞培养液为DMEM培养液，所述的牛血清为胎牛血清；

所述细胞培养所用的温度为36℃～38℃。

9.一种根据权利要求1～8任一项所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法致弱的猪伪狂犬病病毒弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株不能表达gI、gE、11K和28K蛋白；优选地，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株基因从gI基因第890位核苷酸起连续3455bp缺失。