[发明专利]一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组，其特征在于，包括用于检测肠杆菌碳青霉烯酶耐药基因KPC、NDM、OXA48、VIM和IMP的扩增引物对和分子信标探针；

其中，KPC基因的引物组为：

KPC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

KPC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

分子信标探针KPC-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

NDM基因的引物组为：

NDM-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

NDM-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

分子信标探针NDM-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

OXA48基因的引物组为：

OXA48-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

OXA48-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

分子信标探针OXA48-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

VIM基因的引物组为：

VIM-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

VIM-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

分子信标探针VIM-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

IMP基因的引物组为：

IMP-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

IMP-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；

分子信标探针IMP-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

2.一种快速检测碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的快速检测碳青霉烯酶基因的引物组。

3.如权利要求2所述的快速检测碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于，还包括：ExTaq酶，dNTP Mixture，Mg²⁺，RNaseH，DNA模板以及SYBRGreen I；所述DNA模板的浓度为20-100ng/ml。

4.如权利要求3所述的快速检测碳青霉烯酶基因的试剂盒，其特征在于，每25μL PCR扩增反应体系中包含：2U/μL Ex Taq酶1μL，2.5mM dNTP Mixture 4μL，1.5mM Mg²⁺3μL，2.5U/μL RNaseH 1.5μL，SYBRGreen I0.5μL，所述引物组中各引物和分子信标探针分别为0.2μL，ddH₂O补充至25μL。

5.一种非诊断和治疗目的的如权利要求2所述的试剂盒检测肠杆菌碳青霉烯酶耐药基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：提取待检样品中的菌体的DNA；

步骤2：以提取的DNA为模板，利用所述引物组进行五重荧光定量PCR；所述DNA模板的浓度为20-100ng/ml；

步骤3：对扩增产物进行熔解曲线分析，以阳性质控品为对照，以鉴定样品中肠杆菌碳青霉烯酶耐药基因KPC、NDM、OXA48、VIM和IMP。

6.如权利要求5所述的非诊断和治疗目的的试剂盒检测肠杆菌碳青霉烯酶耐药基因的方法，其特征在于，步骤2中PCR反应程序为：95℃10min，95℃10s，58℃15s，72℃20s，45个循环。

7.如权利要求5所述的非诊断和治疗目的的试剂盒检测肠杆菌碳青霉烯酶耐药基因的方法，其特征在于，步骤3中熔解曲线分析程序为：95℃变性1min；升温范围为65℃-99℃，升温速率为0.11℃/s，以5次/℃连续采集荧光信号，进行熔解曲线分析。