[发明专利]一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒以及检测方法，引物组包括用于检测肠杆菌碳青霉烯酶耐药基因KPC、NDM、OXA48、VIM和IMP的扩增引物对和分子信标探针，核苷酸序列SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:15所示。本发明公开的试剂盒只需要一次加样、一个反应管和一个反应体系在2小时内完成五个肠杆菌常见的碳青霉烯酶耐药基因检测，具有快速、高效和准确等优点，大大缩短了检测时间，节约了检测成本，提高了检测效率；并且相比现有的探针法多重PCR，减少了引物设计以及引物间的干扰，可减少假阳性/假阴性的出现。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

细菌耐药性已成为全球性关注的问题，耐药细菌所致感染己成为临床抗感染治疗的新挑战，是当前人类健康和生命的主要威胁。肠杆菌科细菌分布广，与人类关系密切，并且肠杆菌是重要的医院感染菌，碳青霉烯类抗生素是治疗肠杆菌感染的主要抗生素，但近年来，随着碳青霉烯类抗菌药的大量使用，临床出现碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem resistant Enterobacteriaceae，CRE)。目前，在临床上常见的碳青霉烯酶耐药基因主要有KPC、NDM、OXA48、VIM和IMP。虽然市场上已有碳青霉烯酶耐药基因检测的相关试剂盒，但大多是单一检测KPC、NDM、OXA48、VIM和IMP等耐药基因中的一种。

对CRE细菌尽早鉴定和及时报告药敏对指导临床使用合理抗生素至关重要，可有效降低发病率和死亡率。培养鉴定是诊断病原学感染的传统手段，对临床的早期诊治具有重要意义。目前国内实验室普遍采用的培养鉴定流程整体耗时约48-72小时，该方法耗时长，远远不能满足临床对CRE菌株感染快速鉴定和治疗的需要。近年来，随着MALDI-TOF M细菌质谱仪在大型医院的应用，加快了细菌鉴定这一步骤，但对菌株是否耐受碳青霉烯类抗生素依然必需依赖药敏结果。因此传统鉴定方法及细菌质谱鉴定仪都无法实现细菌生长过后数小时就完成CRE菌株鉴定。

基于美国Rutgers大学公共卫生研究院(PHRI)发明的分子信标技术，通过特异性识别核酸序列，可在同一均相系统中同时检测多种基因，具有简捷、快速、特异、灵敏的优点。并且在临床微生物感染与耐药方面已建立了一系列的快速检测诊断平台，包括：耐药结核杆菌、金黄色葡萄球菌鉴定与耐药基因、肠杆菌科细菌鉴定及碳青霉烯类耐药相关基因鉴定。但目前为止，尚未有利用分子信标技术直接检测碳青霉烯酶的试剂盒出现，尤其是没有可以一次同时检测基因KPC、NDM、OXA48、VIM和IMP的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒及检测方法，利用分子信标技术设计特异性引物，并通过分子信标技术利用熔解曲线法进行五重荧光定量PCR，同时实现了快速检测肠杆菌碳青霉烯酶耐药基因KPC、NDM、OXA48、VIM和IMP。该方法节省加样时间、实验成本，具有快速、有效一次性检测多个基因的优势，可以为临床检测及时提供有效数据。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组，包括用于检测肠杆菌碳青霉烯酶耐药基因KPC、NDM、OXA48、VIM和IMP的扩增引物对和分子信标探针；

其中，KPC基因的引物组为：

KPC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

KPC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

分子信标探针KPC-probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

NDM基因的引物组为：

NDM-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

NDM-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；