[发明专利]一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法

说明书

一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法，属于酶工程技术领域。本发明将相同酶活的葡聚糖酶AnEglA6和BglA等体积混合，得到复配型酶液；取10×处理液BG01加入复配型酶液中混合，58‑62℃保温25‑35min，冰水浴冷却；加入第二种10×处理液BG02，在58‑62℃保温25‑35min，冰水浴冷却；继续加入10×处理液BG03，充分混合，即得高稳定性葡聚糖酶。采用本发明方法获得的葡聚糖酶SL04在pH4~6.5范围内活性稳定在60%以上，在4℃环境存储7天酶活下降幅度在40%以内。本发明获得的高稳定性葡聚糖酶在酒精发酵等领域有应用前景。

技术领域

本发明涉及一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

葡聚糖酶主要用于降解生物质原料中的葡聚糖大分子。葡聚糖是一种广泛存在于植物种子中的大分子物质，具有很高的粘度。以淀粉质原料进行的发酵工业中，由于原料中含有一定量的葡聚糖，因此发酵液中添加葡聚糖酶可以有效降低发酵液的粘度，提高搅拌效率，减少搅拌能耗。在酒精发酵工业中，很多酶制剂，如糖化酶、葡聚糖酶等，在使用时一般是直接添加在发酵液中，在发酵过程中逐步水解发酵液中的大分子。微生物的发酵过程很复杂，往往伴随pH的变化，同时酒精发酵倾向于根据市场和工厂所处环境的具体情况选用尽可能廉价的原料，由此配制的发酵液的pH等特性往往有很大的变化，因此具有宽泛pH适应范围的酶制剂在应用上可以获得更稳定的效果。

本发明在前期工作中获得了两种葡聚糖酶，AnEglA6和BglA，前者是一种适应低pH环境的葡聚糖酶，其最适pH在4左右[韩冰, 王施兰, 德青美朵, 沈微, 陈献忠, 樊游. 一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析. 食品与发酵工业,2018, 44(11): 55-62.]，而后者的最适pH在6.5左右[陈玉娟, 沈微, 陈献忠, 王正祥.解淀粉芽孢杆菌 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效表达. 生物技术, 2011, 21(2): 22-26]。本发明将两种葡聚糖酶混合获得一种新的复配型葡聚糖酶，其酶活在pH4~6.5的范围内基本稳定。葡聚糖酶AnEglA6和BglA本身在4℃条件下基本稳定，但这两种酶混合后获得的新型复配型葡聚糖酶却很不稳定，两种酶在混合后大约1小时内酶活基本稳定，随后开始迅速下降，大约4℃下，12小时后剩余酶活不到混合时的20%，因此，这种复配酶难以存储，显然不具有应用的可能性。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法，针对上述葡聚糖酶混合液进行处理，所得的葡聚糖酶混合液的稳定性明显提高。

本发明的技术方案，一种高稳定性葡聚糖酶的制备方法，将相同酶活的葡聚糖酶AnEglA6和BglA等体积混合，得到复配型酶液；取10×处理液BG01加入复配型酶液中混合，58-62℃保温25-35min，冰水浴冷却；加入第二种10×处理液BG02，在58-62℃保温25-35min，冰水浴冷却；继续加入10×处理液BG03，充分混合，即得到高稳定性葡聚糖酶SL04。

所述10×处理液BG01，具体为：10mM柠檬酸-柠檬酸钠，10mM KCl，1mmol/L MnSO₄，2mmol/L CuSO₄，5g/L 凝结多糖，2U菠萝蛋白酶的水溶液，pH为4.1-4.3。

所述10×处理液BG02，具体为：30mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钾，10mM EDTA.Na₂，0.05% SDS，20%酒精，pH为8.0±0.1。

所述10×处理液BG03，具体为：含有50mM柠檬酸-柠檬酸钠，30%酒精，pH为5.5±0.1。

所述葡聚糖酶AnEglA6和BglA。