[发明专利]识别人程序性死亡受体1的DNA适配体及方法和应用

说明书

本发明公开了一种识别人程序性死亡受体1的DNA适配体及方法和应用，属于生化检测领域。利用Cell‑SELEX技术进行适配体的筛选，将构建的pDisplay/PD‑1N表面展示表达质粒转染L02细胞并用G418进行抗性筛选，获得稳定表达PD‑1N的细胞系L02‑PD‑1N。再以L02‑PD‑1N细胞为靶标进行筛选，利用寡核苷酸文库与该细胞系进行反复的多轮孵育‑洗脱‑扩增，以不表达PD‑1N的细胞进行反筛，最终通过鉴定富集的ssDNA亚文库，测序及亲和力比较，获得能高亲和性结合PD‑1N的ssDNA，即核酸适配体。本发明提供识别人PD‑1N的DNA适配体，以该适配体为核心，可利用生物素及荧光标记等用于识别细胞或组织中T淋巴细胞表面的PD‑1分子，具有用于结核及肿瘤等诊断和治疗潜在应用前景。

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种识别人程序性死亡受体1的DNA适配体及方法和应用。

背景技术

程序性死亡受体1也称为PD-1或CD279，是T细胞表面重要的适应性免疫分子。PD-1是一种具有288个氨基酸的I型跨膜蛋白，由一个免疫球蛋白(Ig)超家族结构域，一个跨膜结构域和一个细胞内结构域组成，包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)以及基于免疫受体酪氨酸的开关基序(ITSM)(Keir et al.,2008)。

PD-1具有两个配体分子：PD-L1和PD-L2，属于B7家族成员。PD-1作为免疫检查点分子，可通过两种机制防御自身免疫：促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡(程序性细胞死亡)和减少了调节性T细胞(抗炎，抑制性T细胞)的凋亡。研究表明，PD-1与其配体分子在细胞信号转导中发挥负调控作用，抑制免疫细胞的功能，促进免疫逃逸。PD-1抑制剂可阻断PD-1/PD-L1间的相互作用，增强免疫系统，可用于治疗癌症(Butte et al.,2007)。

肿瘤微环境中T细胞表面的PD-1分子表达水平一般较高(Sharpe and Pauken,2018)，且许多肿瘤细胞以及循环肿瘤细胞一般高表达PD-L1分子(Gandini et al.,2016；Syn et al.,2017)，抑制PD-1/PD-L1间的相互作用可增强T细胞反应并介导临床前抗肿瘤活性(Baumeister et al.,2016)。

指数富集的配体系统进化技术(SELEX)的筛选方法是指从序列数巨大的随机文库中筛选出功能性的针对特定靶标的核酸适配体(Ellington and Szostak,1990)。该技术是指经由反复多轮结合，分离，和扩增获得所需单链DNA或RNA的逐步筛选过程，并将这种具有特异性结合能力的寡核苷酸序列命名为“aptamer”，即核酸适配体(Tuerk and Gold,1990)。适配体可通过静电相互作用，范德华力，氢键，疏水作用，Π-Π堆积以及分子形状互补等形成特定的空间结构，从而与靶标分子发生高亲和性和高特异性的结合，其解离常数Kd值通常在皮摩尔到纳摩尔范围内(Hermann and Patel,2000)。

适配体也被称为“化学抗体”，在功能上被用作拮抗剂，激动剂或靶向配体。，适配体与抗体相比具有独特的优势：如化学合成的容易性，小尺寸，低分子量和非免疫原性，且能根据实际需要对其加以修饰(Zhou and Rossi,2017)。适配体的这些特性使其在诊断治疗等生物医学领域具有极大的应用潜能，基于这些优势，适配体的研究项目在日益增多，获得的适配体可广泛用于生物诊断，生物标志物发现，分子成像，靶向治疗和药物递送等。2004年，美国食品药品管理局(FDA)批准了第一个适配体药物pegaptanib(商品名Macugen)用于治疗老年性黄斑变性新型血管形成(AMD)，这标志适配体药物正式进入临床治疗。

发明内容

本发明的目的之一，提供了一种特异性识别人PD-1N的DNA适配体。

本发明的另一目的在于提供产生上述DNA适配体的筛选及鉴定方法。