[发明专利]快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB的分子标记引物及应用

说明书

本发明公开了一种快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB的分子标记引物及应用。针对敏色素基因PHYB野生型和突变体的基因序列所存在的特异性差异位点，本发明设计了如Seq No.3‑5所示的分子标记引物PHYB‑Allele1/Allele2/Common，利用该引物进行PCR扩增和荧光信号扫描：红色点图为PHYB突变型，蓝色为野生型，绿色为杂合体型。本发明的分子标记具有快速省时(省去电泳试验检测)，健康环保(避免有毒试剂溴化乙锭使用)，精准(避免电泳检测观察误差)的优势，为后续分子育种筛选提供有力工具。

技术领域

本发明涉及一种快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变型的分子标记引物及应用，属于植物生物技术领域。

背景技术

高等植物利用光敏色素(phytochromes)、隐花色素(cryptochromes)和向光素(phototropins)等光受体，感受其生长环境中光质、光强、光周期等条件的变化，调节自身的生长发育，以最大限度适应周围环境。其中，光敏色素主要感受红光(red light,R)和远红光(far-red light,FR)。水稻中光敏色素基因家族包括3个成员：PHYA、PHYB和PHYC。其中PHYB基因位于水稻的第3染色体短臂，为单拷贝。Takano等(2005)通过伽马射线诱导突变筛选得到了多个phyB突变体，分别命名为phyB1～phyB5。其中phyB1突变体在PHYB基因内部1644bp处插入一个碱基C，从而引起翻译提前终止(Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325)。通过分析水稻光敏色素突变体的光形态建成特征，发现phyB在水稻生长发育和胁迫反应中具有重要作用。phyB突变体无论是长日照条件还是短日照条件下，开花期均明显提前(Takano等，2005，Plant Cell,2005,17:3311-3325)；其干旱胁迫耐性也明显增强(Liu等，2012，PlantMol Biol.,78(3):289-300)；而且对于稻瘟病具有一定的抗性(Xie等，2011，Mol.Plant 4(4):688-696)。

将PHYB的突变体基因型导入水稻优良受体材料，提高水稻品种的花期、耐旱及抗病性，将具有广阔的应用前景。分子标记是一段能反映种间基因组差异的特异性DNA片段。利用分子标记辅助选择，是一种简易操作、成本低廉的检测技术。Takano(2005)等开发了一种鉴定phyB1突变体的分子标记，但该标记扩增片段较大(1Kb)，GC含量较高，要用高GC的PCRbuffer进行扩增，而且PCR扩增时间较长，且用于酶切的限制性内切酶NlaIV属于罕见的限制性内切酶，购买困难，且价格昂贵(3.49元/U，NEB北京)，提高了鉴定成本，不适用于大规模的鉴定；经常出现没有库存、断货等现象，严重影响鉴定工作顺利进行。申请人于2016年开发了一种鉴定phyB突变体的分子标记(CN106282345B)，但该技术必须通过琼脂糖电泳试验进行鉴定区分，试验时间过长且存在有毒试剂操作，无法完全避免电泳条带读取误差。

发明内容

本发明的目的在于针对敏色素基因PHYB野生型和突变体的基因序列所存在的特异性差异位点，提供一种快速省时(省去电泳试验检测)，健康环保(避免有毒试剂溴化乙锭使用)，精准(避免电泳检测观察误差)的PARMS分子标记引物及应用。

本发明的技术方案是：一种快速高效鉴别水稻光敏色素基因PHYB的分子标记引物，具体为：

上游引物PHYB-Allele1：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCCAGCATCATGGACCC-3’(Seq No.3)；

下游引物PHYB-Allele2：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCCAGCATCATGGACCT-3’(Seq No.4)；

通用引物PHYB-common：