[发明专利]一种干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、样品前处理

取样：取干血斑样本，用打孔器取3.2毫米滤纸干血片3片加入到96孔U型板中，然后加入200μL甲醇溶液与10μL 10μg/mL 25(OH)D3-¹³C5和25(OH)D2-D3的混合内标溶液涡旋振荡混匀30min，取180μL上清液至96孔V板中，35-60℃氮气直至吹干；

衍生：加入50μL衍生剂为4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮的衍生液至吹干后的96孔V板中，涡旋振荡30min；

终止：加入50μL超纯水溶液终止，涡旋振荡30min，将96孔板V板置于高效液相色谱串联质谱系统中进行检测；

S2、采用LC-MS/MS法检测

高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪，通过高效液相色谱串联质谱法测定经所述步骤S1预处理后的样品检测溶液；所述步骤S2是采用梯度洗脱反相色谱法分离待测物，利用串联四级杆质谱仪进行检测的测定条件包括：

LC条件：Waters BEH C18柱；50×2.1mm，填料粒径1.7μm；柱温：30～45℃；进样体积：20～40μL；流动相A：0.5mM乙酸铵水溶液；流动相B：0.5mM乙酸铵甲醇溶液；洗液：弱洗-70％乙腈，强洗-乙腈；所述梯度洗脱的条件包括：

MS条件：离子源：APCI离子源；扫描模式：电喷雾离子源(ESI)和MRM模式；毛细管电压：3.5KV；离子源加热温度：500℃；气源流速：800L/Hr；其他检测条件包括：

S3、标准曲线的绘制：配制标准液，以上述LC-MS/MS条件分别检测所述标准液，并根据检测结果绘制相应的标准曲线。

2.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，其特征在于：所述步骤S2中的检测的目标定量离子对包括25-OHD2衍生化产物和25-OHD3衍生化产物的母离子/子离子检测对如下所示：25-羟基维生素D3 m/z558.4＞m/z298.2、25-羟基维生素D2 m/z570.4＞m/z298.2；所述步骤S2中检测的内标衍生化产物的检测离子对为25-羟基维生素D3内标衍生化产物m/z563.4m/z298.2和25-羟基维生素D2内标衍生化产物m/z573.4＞m/z301.2。

3.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，其特征在于：所述干血斑样本包括干血斑标准曲线样本、质控干血斑样本和需要检测的血斑样本。

4.根据权利要求3所述的干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，其特征在于：所述质控干血斑样本的制备是通过取处理过的全血，分别与30μL、150μL浓度为1μg/mL的25-羟基维生素D混匀至2mL，取75μL滴于滤纸片上，分别获得15ng/mL和75ng/mL质控干血斑样本。

5.根据权利要求1所述的干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，其特征在于，所述步骤S3中干血斑标准曲线的制作：取处理过的全血，分别与10μL、20μL、40μL、100μL、160μL、200μL浓度为1μg/mL的25-羟基维生素D混匀至2mL，取75μL滴于滤纸片上，获得5-100ng/mL干血斑标准曲线样本，以步骤S2中LC-MS/MS法的测试条件分别检测所述干血斑标准曲线样本，并根据检测结果绘制相应的干血斑标准样本曲线。