[发明专利]一种干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种干血片中25‑羟基维D的LC‑MS/MS高通量检测方法及试剂盒；其样品前处理工艺主要包括取样，衍生，复溶后采用LC‑MS/MS进行检测，高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪，通过高效液相色谱串联质谱法测定经前处理后的样品复溶；本申请提供的方法和试剂盒满足了临床大批量样品分析的需求，与现有技术相比具有操作简单、提取时间短、适合高通量样品预处理的特点。

技术领域

本发明涉及一种维生素D的检测领域，尤其涉及一种干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法及试剂盒。

背景技术

维生素主要由食物供给，是人体健康所必须的一类基本营养物质，是维持机体正常的生理功能和细胞内特异代谢反应所必须的一类小分子有机物。根据其极性大小可分为脂溶性和水溶性维生素。其中，脂溶性的维生素D在维持人体钙的动态平衡方面起着非常重要的作用，能和钙一起促进儿童骨骼的形成和维持成人骨骼强度。在儿童中，维生素D的缺乏会导致骨骼畸形，如出现佝偻病等；而在成人中，维生素D的缺乏会导致骨质疏松症。当机体摄入并蓄积过量的维生素D时，体内维生素D负反馈调节作用失调，会导致高钙血症及一系列不良反应，如恶心、呕吐、便秘、胰腺炎、急性肾脏损伤等。维生素D存在两种主要的活性形式，分别为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。二者是维生素D在血液循环中的主要存在形式，可作为维生素D的检测指标。因此监测血液内25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量，有助于评价人体维生素D的状况。

目前临床常用的25-羟基维生素D检测方法主要为酶免疫分析法、竞争蛋白结合法、高效液相色谱法等。然而，酶免疫分析法无法区分25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3，无法检测人体内25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3的含量。竞争蛋白结合法存在严重基质效应，影响了定量检测结果的准确性。近年来已被广泛应用的高效液相色谱法样本前处理步骤相对繁琐，且无法实现快速高通量检测，这在一定程度上限制了该精准检测方法在25-羟基维生素D在临床检测方面的应用。

目前，新生儿疾病筛查时广泛使用的干燥生物流体样品，例如干滤纸干血片(DBS)在临床试验中变得越来越流行。DBS采样法对样本采集者的技术要求低，血样采集的过程被简化，采血量小(通常小于100μL)，干燥后的样本具有很好的生物稳定性且拥有很好的生物安全性，可在室温下储存和运输。由于干血片样本中含血量较少，通常的检测方法很难从干血片中检测维生素D的含量。然而，串联质谱(MS/MS)的原理是将两个质谱仪经一个碰撞室串联而成，能够大大提高检测的特异性和灵敏性。因此，有必要发明一种抗干扰能力强、灵敏度高、特异性强，且操作简便快速的25-羟基维生素D检测试剂盒。

发明内容

本发明目的在于提供了一种简便快速、精度高，适合大批量样品检测的干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法及试剂盒。

为了实现上述目的，本发明提供了一种干血片中25-羟基维D的LC-MS/MS高通量检测方法，包括以下步骤：

S1、样品前处理

取样：取干血斑样本，用打孔器取3.2毫米滤纸干血片3片加入到96孔U型板中，然后加入200μL甲醇溶液与10μL 10ng/mL 25(OH)D2-D6和25(OH)D3-D3的混合内标溶液涡旋振荡混匀30min，取180μL上清液至96孔V板中，35-60℃氮气直至吹干；

衍生：加入50μL衍生剂4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)衍生液，涡旋振荡30min；

终止：加入50μL超纯水溶液终止，涡旋振荡30min，将96孔板V板置于高效液相色谱串联质谱系统中进行检测；

S2、采用LC-MS/MS法检测

高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪，通过高效液相色谱串联质谱法测定经所述步骤S1预处理后的样品复溶，采用串联四级杆质谱仪进行检测。