[发明专利]一种鳜鱼传染性脾肾坏死病PCR快速检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种鳜鱼传染性脾肾坏死病PCR快速检测试剂盒，其特征在于，包括PCR试剂管、DL5000DNAMaker、GoldViewDNA染料、6XLoadingBuffer、阴性和阳性对照品、检测胶、1XTAE电泳缓冲液和DNA分子量标准maker。

2.根据权利要求1所述的一种鳜鱼传染性脾肾坏死病PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂管中包含10ⅹbuffer（Mg²⁺）、TaqDNA聚合酶、dNTP、ddH₂O、引物一对。

3.根据权利要求2所述的一种鳜鱼传染性脾肾坏死病PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物简称ORF007LF，引物序列为CGACACAAAGATACGCAGCAC，下游引物简称ORF007LR，引物序列为GCCACAAACAGCATCAAGCA。

4.根据权利要求2所述的一种鳜鱼传染性脾肾坏死病PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述引物的扩增片段长度为162bp。

5.根据权利要求2所述的一种鳜鱼传染性脾肾坏死病PCR快速检测试剂盒，其特征在于，阳性对照品为鳜鱼传染性脾肾坏死病DNA片段的DNA样本；阴性对照品为健康鳜鱼DNA的DNA样本。

6.根据权利要求1所述的一种鳜鱼传染性脾肾坏死病PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂管、DL5000DNAMaker、GoldViewDNA染料、6XLoadingBuffer、阴性和阳性对照品、检测胶、1XTAE电泳缓冲液和DNA分子量标准maker的均保存于-20摄氏度。

7.一种鳜鱼传染性脾肾坏死病PCR快速检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

A、用DNA提取试剂盒提取鳜鱼传染性脾肾坏死病病样的肝、脾、肾组织的DNA；

B、把需要使用的含有47μl试剂的PCR管用普通离心机3000rpm离心1mim；

C、每个PCR管分别加入3μl步骤B中提取的DNA模板；

D、取两个离心后的PCR管分别加入3μl阳性DNA样本和3μl阴性DNA样本；

E、把上述所有PCR管放入PCR仪上，设定本发明PCR扩增程序：PCR反应管置于，反应条件为：94℃预变性120s；94℃变性30s，61℃退火45s，72℃延伸60s；30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

F、PCR扩增结果电泳：称取0.6g琼脂糖50ml的1XTAE电泳缓冲液中，混合均匀并加热溶解，然后加入3μlGoldViewDNA染料，倾倒凝胶板，凝胶冷却凝固后，取8μlPCR扩增产物与2μl6XLoadingBuffer混合，同时一孔加入DNA分子量标准maker8μl；

G、加入凝胶孔中进行电泳；

H、电泳结束后取出凝胶，用紫外仪于暗处观察并拍照；

I、结果判定：如果阳性对照孔有目的条带而阴性对照孔无任何条带说明PCR反应检测成功，否则本次检测失败，需重新重复步骤B-G，若在162bp处出现明亮的反应条带，则判定为鳜鱼传染性脾肾坏死病阳性，否则为阴性。