[发明专利]一种TERT突变检测试剂盒及在肿瘤无创诊断中的应用

说明书

本发明具体涉及一种TERT突变检测试剂盒及在肿瘤无创诊断中的应用。本发明提供一种基于ddPCR方法检测TERT基因启动子突变的引物组合、试剂盒、方法及应用(ddPCR‑TERTpm试剂盒)，以解决现有技术中检测复杂、低敏感的问题。ddPCR‑TERTpm试剂盒适于膀胱、肾盂癌病人肿瘤和尿液突变TERT启动子检测。尿液DNA提取后进行ddPCR扩增分析，具有快速、简便、高度灵敏及特异等优点。此外，该检测试剂盒或技术也适用于恶性黑色素瘤、脑胶质细胞瘤、肝细胞性肝癌等肿瘤和血液标本的检测，以及甲状腺肿瘤及细针穿刺标本来源的DNA的分子诊断。

技术领域

本发明属于TERT突变检测技术领域，具体涉及一种膀胱癌(bladder cancer,BC)、肾盂癌(Renal pelvic cancer，RPC)肿瘤细胞携带端粒酶启动子(TERTp)突变(C228T或C250T)的ddPCR检测方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

膀胱癌(bladder cancer,BC)是我国及全球最常见的泌尿系恶性肿瘤，年发病数达350 000人。由于BC易复发，病人需要终生监护随访。膀胱镜和尿液脱落细胞学检查是常规方法，但前者费用较高，而且具有创伤性，给病人造成痛苦，后者灵敏度低，特别是对于低度肿瘤病人，易于漏诊。最近几年以色列Nucleix公司推出Bladder EpiCheck^TM试剂盒用于膀胱癌病人尿液DNA甲基化检测(共包括15个基因)以监测病人手术后病情，但灵敏度、特异性及阳性预测值分别为68％、88％、45％(Eur Urol Oncol.2018；1:307-313)，远不够理想。有鉴于此，目前亟需创建特异、准确，敏感，非创伤性检测方法以用于膀胱癌病人诊断，病情复发的监护。

肾盂癌(Renal pelvic cancer，RPC)，与BC一样起源于泌尿上皮细胞，属于移行细胞癌，但发病相对少，占所有泌尿系肿瘤的10％。然而，过去20年来，RPC发生率明显上升，并且由于缺少早期症状及有效诊断手段，大多数病人发现时已非早期。因此，发现可靠的RPC标记物，创立准确而敏感的检测方法很有必要。

恶性肿瘤特异性端粒酶活化在癌变，进展过程之中具有极为重要作用。端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)系端粒酶的限速成分，正常细胞鲜有存在，但在癌变时转录激活表达。最近发现TERT启动子突变即C228T和C250T发生在许多恶性肿瘤包括BC和RPC。此外，甲状腺癌、肝细胞性肝癌、恶性黑色素瘤、恶性胶质瘤等也常常发生TERTp突变。因为这些TERTp突变不存在于正常组织细胞，所以C228T及C250T突变检测成为可靠而特异的BC、RPC标记。现有资料表明，高达84％BC和50％RPC病人肿瘤细胞携带C228T或C250T突变(其中绝大多数为C228T突变)，发明人利用Sanger测序分析病人尿液来源的DNA，检测到突变的存在。最近报道还发现甚至在膀胱癌临床诊断之前10年病人尿中即可检测到突变TERTp。所以，TERTp突变可以作为BC、RPC病人尿液标志，同时也可以作为健康成年人肿瘤早期筛查的标记。

发明内容

基于上述背景技术中记载的内容，本发明目的在于提供一种无创、灵敏且特异性强的检测方法，提高膀胱癌诊断、监测病情进展的便利性。基于该技术目的，本发明提供了一种优化的ddPCR检测方法，以尿液为检测样本检测TERTp突变，检测下限可以达到0.05％。

依据上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种引物组合，所述引物组合的序列如下：

forward：5’-CCTGCCCCTTCACCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.1)；