[发明专利]一种生产去甲四环素的方法

说明书

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产去甲四环素的方法，将去甲金霉素生产菌株接种斜面培养基，25‑30℃，20％‑60％湿度条件下培养10‑15天；成熟后接种至种瓶培养基，25‑30℃，20％‑60％湿度条件下220rpm震荡培养36‑50h；种液成熟后，按照5％‑10％接种量接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养5‑8天，发酵结束，得到去甲四环素发酵液；本发明提高了去甲四环素的发酵单位，达到了工业化生产水平，对米诺环素、替加环素等高附加值产品生产过程中简化合成步骤，减少危险因素，降低生产成本具有重要的意义和应用价值。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产去甲四环素的方法。

背景技术

四环素类抗生素(Tetracyclines)是一类具有并四苯(Naphthacene)核心结构的广谱抗生素(图1)，包括土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四环素(TC)、去甲金霉素(DMCTC)、去甲四环素(DMTC)、强力霉素、米诺环素、替加环素等(Nguyen F,StarostaAL,Arenz S,SohmenD,DonhoferA,Wilson DN(2014)Tetracycline antibiotics and resistancemechanisms.Biological chemistry 395(5):559-75)。在这些抗生素中，OTC、CTC、TC、DMCTC和DMTC是天然产物，OTC由Streptomyces rimosus产生，CTC、TC、DMCTC和DMTC由Streptomyces aureofaciens或其突变体产生。

随着耐药菌株的出现和人们对广谱抗生素的迫切需求，研究者在这些天然产物的基础上，通过化学修饰，开发合成了强力霉素、米诺环素、替加环素等更加高效的四环类抗生素，如：以土霉素为原料可以合成强力霉素，以去甲金霉素为原料可以合成米诺环素、替加环素等。值得指出的是，2018年有3款四环素类抗生素获得FDA批准：Eravacycline、Sarecycline和Omadacycline。因此，提高生物合成类产品的产能具有重要意义。

在实际生产中，以去甲金霉素为原料合成去甲四环素(图2)，然后以去甲四环素为原料合成米诺环素，米诺环素可以进一步合成价值更高的替加环素。去甲金霉素为原料合成去甲四环素的过程需要经过金属钯(Pd)催化的高压氢化脱氯反应，此反应危险并且成本高，所以，如果能够通过发酵法生产去甲四环素，可以简化米诺环素、替加环素等合成的步骤，减少危险因素，降低生产成本。

在目前的研究中，通过发酵法合成OTC、CTC、TC、DMCTC的研究很多，并且均已工业化生产，而去甲四环素(DMTC)的研究报道很少。CN201910693880.8通过敲除金霉素生产菌株S.aureofaciens CGMCC4.1043中编码甲基转移酶的ctcK基因，获得产去甲四环素的工程菌株DMT1，并在此基础上通过表达合成簇内激活基因ctcB、抗性基因ctcR、合成基因ctcQ等策略，进一步提高了去甲四环素的产量；CN201911007748.3通过调整发酵罐培养基组成、调整补料配方，配合发酵过程工艺控制，得到了一种使用金色链霉菌发酵生产去甲四环素的方法。

在去甲金霉素发酵过程中，去甲四环素是其中杂质之一，产量很低。去甲四环素与去甲金霉素的结构差别是7位缺少氯原子，所以推测合成过程是先合成去甲四环素，然后7位卤化加氯，合成去甲金霉素。在去甲金霉素发酵过程中，如果能够通过改变工艺条件，使发酵主产物由去甲金霉素转为去甲四环素，用于去甲四环素的生产，则具有重要的应用价值。

鉴于此，本发明开发了一种通过去甲金霉素生产菌株S.aureofaciens(金色链霉菌)生产去甲四环素的方法及培养基。

发明内容

本发明为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种生产去甲四环素的方法，采用去甲金霉素生产菌株金色链霉菌，通过改变培养基和发酵条件，用于生产去甲四环素。