[发明专利]一种检测肾损伤标志物胱抑素C的方法

权利要求书

1.一种免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法以DPPC、胆固醇、DPPE为原料，利用薄膜分散法制备脂质体；用制备得到的脂质体包封精氨酸，获得免疫脂质体。

2.根据权利要求1所述的免疫脂质体的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

a)称取DPPC、胆固醇、DPPE放置于离心管中，加入氯仿和甲醇溶液，超声溶解；

b)将步骤a)超声后的溶液置于圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪进行减压蒸发，在烧瓶的内壁形成脂质膜；

c)将精氨酸预先溶解在PBS中，充分溶解后，加入步骤b)中内壁形成脂质膜的烧瓶中，同时水浴摇晃烧瓶，使内壁上的脂质膜溶解脱落，获得包封精氨酸的多层脂质体；

d)将步骤c)获得的包封精氨酸的多层脂质体放入超声破碎仪中同时进行冰水浴和超声；

e)将步骤d)超声后的溶液离心，吸取上清液使用截留分子量为8000的半透膜透析，除去未被包埋的精氨酸，获得所述的精氨酸脂质体。

f)将步骤e)获得的精氨酸脂质体加入2.5％(w/v)戊二醛溶液，所述精氨酸脂质体与戊二醛溶液的体积比为2:3，，轻轻摇匀后，在25℃下孵育1h；将获得的溶液在PBS中，4℃下透析24h除去过量的戊二醛；加入胱抑素C抗体2于精氨酸脂质体中，所述胱抑素C抗体2与精氨酸脂质体的用量比为1μg:10μL，混匀后在旋转仪上孵育，25℃下孵育1h；未结合的胱抑素C抗体2用100KD的超滤管4℃12000rpm 20min重复超滤3次；将超滤获得的液体加入PBS(1％BSA)中，所述超滤获得的液体与PBS(1％BSA)的体积比为1：2，在25℃下孵育1h，以达到封闭醛基的目的，获得所述的免疫脂质体。

3.根据权利要求2所述免疫脂质体的制备方法，其特征在于，还包括将步骤f)获得的免疫脂质体4℃保存。

4.根据权利要求2所述免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，DPPC、胆固醇、DPPE的质量比为(55～65)：(35～35)：(5～10)，氯仿和甲醇的体积比为(3～6)：(1～2)，所述DPPC、胆固醇、DPPE混合物在氯仿和甲醇溶液中的浓度为15mg/ml。

5.根据权利要求2所述免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤c)中，精氨酸与脂质膜的质量比为(4～10)：(2～3)。

6.采用权利要求1至5任一项权利要求所述的制备方法制备得到的免疫脂质体。

7.根据权利要求6所述的免疫脂质体，其特征在于，所述免疫脂质体直径为140±40nm。

8.权利要求6所述的免疫脂质体在制备检测肾损伤标志物胱抑素C的试剂或者试剂盒中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测肾损伤标志物胱抑素C的试剂或者工具对胱抑素C的最低检测值为15μg/L。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：

1)采用权利要求1至5任一项权利要求所述的制备方法制备免疫脂质体；

2)免疫磁珠-胱抑素C复合物的形成：将待测血清加入混匀的免疫磁珠，所述免疫磁珠为经胱抑素C抗体1标记的免疫磁珠，37℃孵育20～40min后，得到免疫磁珠-胱抑素C复合物；

3)免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物的形成：向步骤2)中形成的免疫磁珠-胱抑素C复合物中加入免疫脂质体，混匀后37℃放置20～40min，形成免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物；优选的，所述加入的免疫脂质体浓度为0.8×10⁸个/mL～9.6×10⁸个Lipid/mL；

4)磁性分离：对免疫磁珠-胱抑素C-免疫脂质体复合物进行磁吸附，所述磁吸附时间为1～5min，弃去未被吸附的液体，得到吸附产物；

5)人工破膜：向步骤4)得到的吸附产物中加入含10mM TritonX-100的PBS，脂质体破膜后释放出包裹的精氨酸；优选的，所述破膜剂为TritonX-100破膜剂；优选的，所述含10mMTritonX-100的PBS体积为200μL；

6)显色检测：取步骤5)破膜后的液体，加入到纳米金溶液中，所述破膜后的液体与纳米金溶液的体积比为1：20，通过颜色变化以及紫外吸收强度分析精氨酸的量来确定样本中胱抑素C的含量。