[发明专利]一种检测肾损伤标志物胱抑素C的方法

说明书

本发明提供一种检测肾损伤标志物胱抑素C的方法。该方法首先加入免疫磁珠与待测溶液混合，特异性捕获肾损伤标志物胱抑素C，再加入免疫脂质体孵育一段时间后形成免疫磁珠‑胱抑素C‑免疫脂质体夹层三明治结构复合物，之后进行磁性分离并加入TritonX‑100对免疫脂质体进行破膜，利用免疫脂质体释放出的精氨酸促使纳米金聚集显色而实现胱抑素C的高灵敏、快速、可视化检测。本发明利用免疫脂质体扩增反应和纳米金显色相结合，能实现肾损伤标志物胱抑素C的高灵敏度检测，并且具有检测时间短，可视化检测，成本低，特异性高等优点。

技术领域

本发明涉及属于纳米生物检测技术领域，尤其涉及一种免疫脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

脂质体免疫传感器是指将脂质体应用于免疫检测的一种新型生物传感器，免疫传感器由于只对抗原与抗体的特异性吸附进行检测，避免了非特异性吸附的干扰，从而提高了传感器的准确性和专一性。而脂质体是由磷脂和胆固醇组成的，具有磷脂双分子层的球形纳米级囊泡，由于其结构的特殊性能够包埋或吸附大量信号物质或其他生物识别分子，从而能够达到信号放大增强检测信号的目的。因此，脂质体免疫传感器不仅有传统免疫传感器的特异性和高效性，而且还在此基础上放大了信号，极大提高了传感器的灵敏度。

比色传感器是以颜色变化为分析基础，通过裸眼观察或分光光度计，直接或间接实现对颜色变化的靶标进行定性、定量检测。其具有肉眼直接观察，易操作，成本低，检测速度快，实时高效，且不需要实验室仪器等优点。纳米金颗粒会因为纳米颗粒之间的距离的改变，导致相邻颗粒之间的表面等离子耦合，使得等离子体共振光谱发生移位从而导致溶液颜色的改变，由于其低成本、易合成、距离变化后颜色改变明显等特点，使其在比色传感检测中具有很好的竞争力。

急性肾损伤是由多种病因引起的高致死率的一种临床综合征，在临床上是一个严重并长期存在的问题，在过去10多年的时间里，急性肾损伤在住院患者中发病率约为3.2％～9.6％，在老年患者中为14.8％。而在重症患者中高达22％。而且由于缺乏有效的治疗方法，接近半数的急性肾损伤患者会变为慢性肾病。因此，通过关键指标对急性肾损伤的发生进行早期诊断、早期干预、及时治疗对降低急性肾损伤的发病率和死亡率具有积极意义。

胱抑素C即半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，是一种低分子量蛋白，分子量为13.3KDa，由122 个氨基酸残基组成，在所有组织的有核细胞中持续恒定的转录和表达，且没有组织特异性，体液中的浓度不会受到年龄、性别、代谢水平和营养状况等因素所影响。正常机体状态下，在人体的血清胱抑素C由肾小球滤过后，在近端小管全部重吸收及分解，不会重新回到血液循环中。一些研究表明血清胱抑素C的浓度与肾功能的损伤程度高度相关，且能比传统的肾损伤标志物血肌酐、尿素氮能更早地反映肾功能的下降，能够更加及时准确的反映人体肾小球滤过率的改变，从而能够更早地诊断肾损伤。但是，目前的检测胱抑素C的方法大多操作复杂、价格昂贵、需要实验室仪器，因此开发一种高灵敏、操作简便、快速高效的检测血液中胱抑素 C的新方法，对肾损伤的早期诊断具有重要意义。

发明内容

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种免疫脂质体的制备方法，所述制备方法以DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、胆固醇、DPPE(二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺)为原料，利用薄膜分散法制备脂质体；用制备得到的脂质体包封精氨酸，获得免疫脂质体。

进一步的，所述免疫脂质体的制备方法包括如下步骤：

a)称取DPPC、胆固醇、DPPE放置于离心管中，加入氯仿和甲醇溶液，超声溶解；

b)将步骤a)超声后的溶液置于圆底烧瓶中，用旋转蒸发仪进行减压蒸发，在烧瓶的内壁形成脂质膜；

c)将精氨酸预先溶解在PBS中，充分溶解，加入步骤b)中内壁形成脂质膜的烧瓶中，同时水浴摇晃烧瓶，使内壁上的脂质膜溶解脱落，获得包封精氨酸的多层脂质体；