[发明专利]特异性检测TWI型传染性支气管炎病毒的反转录-实时荧光定量PCR试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种特异性检测TW I型IBV的RT-qPCR引物和探针，其特征在于，选自下述两套检测引物和探针之一，其中第一套检测引物和探针包括：上游引物TW I/F1序列为5’-AGAGATGTTGGRGAAGTCACTGTT-3’(SEQ ID NO.8)，下游引物TW I/R1序列为5’-CTCTGGTAGTAGTAAACGTACGTATCATTATC-3’(SEQ ID NO.9)，探针TW I/Probe1序列为5’-CACTATCTAGTGCTACTTTGTAT-3’(SEQ ID NO.10)，所述荧光探针5’和3’端分别标记6-FAM基团和MGB基团；

第二套检测引物和探针包括：上游引物TW I/F2序列为5’-CGCTTATGCAGTAGTAAATGTTTCTTCAC-3’(SEQ ID NO.11)，下游引物TW I/R2序列为5’-CCACCGCATACCTTGACCTACA-3’(SEQ ID NO.12)，探针TW I/Probe2序列为5’-CATTAACAACTGTATCACCACT-3’(SEQ ID NO.13)，所述荧光探针5’和3’端分别标记6-FAM基团和MGB基团。

2.一种特异性检测TW I型IBV的RT-qPCR试剂盒，其特征在于，试剂盒中含有权利要求1所述第一套检测引物和探针或/和第二套检测引物和探针。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包含阳性标准品，所述的阳性标准品是含有TW I型IBV S1基因片段的质粒，所述的质粒是用引物TWI-S1F和TWI-S1R引物对从TW I型IBV毒株CK/CH/AH/2011/3基因组cDNA扩增出的包含完整S1基因的DNA片段连接到pEasyT3载体上得到的，所述引物TWI-S1F序列为5’-CTGCACGCAAATTATATATTTTGG-3’(SEQ IDNO.14)，所述引物TWI-S1R序列为5’-GTATGTACTCATCTGTAACAGT-3’(SEQ ID NO.15)，扩增目的片段大小为2kb。

4.如权利要求2或3所述试剂盒的使用方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

(1)提取病毒样本的总RNA；

(2)反转录为cDNA；

(3)标准曲线建立将阳性标准品质粒从10⁹拷贝/μl到10¹拷贝/μl系列稀释作为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行实时荧光定量PCR扩增，用于建立标准曲线；

(4)以步骤(2)反转录的cDNA为模板，以权利要求1中所述的引物和探针进行荧光定量PCR扩增；

(5)PCR反应过程中自动检测、采集荧光信号，根据标准曲线对待检样本中的病毒含量进行定量。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应体系为20μl，20μl体系里含有10μl、2×qPCR Probe Master Mix、0.4μl上游引物、0.4μl下游引物、0.2μl探针、2μl模板cDNA和7μl无菌水。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR的反应条件为：95℃5min；95℃10s、60℃30s，40个循环。