[发明专利]一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法

权利要求书

1.一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法，

所述抗凝血药物分别为：达比加群、利伐沙班和阿哌沙班；

上述抗凝血药物对应的同位素内标物分别为：达比加群-13C6、利伐沙班-d4和阿哌沙班-13C,d3；

采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗凝血药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗凝血药物的含量，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

流动相A：0.001％～0.01％甲酸水溶液；流动相B：0.001％～0.01％甲酸甲醇溶液；

色谱柱型号：Agilent Poroshell 120EC-C18；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至30:70；在1.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至90:10每个样品采集时间为4.5分钟；

(2)质谱条件：

在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；毛细管电压为0.5kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述流动相A为0.001％～0.005％甲酸水溶液；流动相B为0.001％～0.005％甲酸甲醇溶液；流速为0.2～0.5mL/min；柱温为30～50℃；进样体积为0.2～10μL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述流动相A为0.004％甲酸水溶液，流动相B为0.004％甲酸甲醇溶液；所述流速为0.3mL/min；所述柱温为40℃；所述进样体积为1μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物血浆。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为乙腈。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入180μL乙腈，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，

所述混合内标工作液按照如下方法制备：

将50μg/mL达比加群-13C6同位素内标母液、25μg/mL利伐沙班-d4同位素内标母液和50μg/mL阿哌沙班-13C,d3同位素内标母液以乙腈水溶液配制成包含有500ng/mL达比加群-13C6、250ng/mL利伐沙班-d4和500ng/mL阿哌沙班-13C,d3的混合内标溶液；

取100μL混合内标溶液，加入900μL乙腈水溶液，混合均匀得混合内标工作液。