[发明专利]一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法

说明书

本发明提供一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法，前处理过程简单、灵敏度高、分析时间短、样本用量少，4.5分钟之内完成抗凝血药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗凝血药物的定量分析，为临床上抗凝血药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

技术领域

本发明属于血浆检测技术领域，具体涉及一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法，具体抗凝血药物为：达比加群(Dabigatran，DBT)、利伐沙班(Rivaroxaban，RXB)和阿哌沙班(Apixaban，AXB)。

背景技术

治疗药物监测(TDM)是针对不同患者个体，量体裁衣式地制定给药方案的一种方法。通过定量测定血浆或血浆中药物浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低毒副作用。LC-MS/MS的方法可以实现快速、高通量、准确的检测体内抗凝血药物浓度，为临床上实时监测体内抗凝血药物浓度，达到最佳的治疗效果，尽可能的减少不良反应的发生。

达比加群(DBT)是一种强极性的两性化合物，不溶于有机溶剂，达比加群酯是前药，在体内被转化为达比加群而发挥抗凝作用。达比加群酯是一种人工合成的新型口服抗凝抑制剂，它能可逆地竞争性抑制凝血酶活性，属于非肽类凝血酶抑制剂。其口服后通过消化道迅速吸收，在血浆和肝脏内通过酯酶水解可以产生活性代谢产物达比加群，通过抑制凝血酶发挥抗凝活性。利伐沙班(RXB)和阿哌沙班(AXB)均属于选择性Ⅹa因子抑制剂，它不需要抗凝血酶Ⅲ参与，可直接拮抗游离和结合的Ⅹa因子，临床用于择期髋关节或膝关节置换术的成年患者，以预防静脉血栓形成。

目前，已有文献报道采用HPLC-UV和LC-MS/MS法测定血浆中的药物含量。中国临床药理学杂志第35卷第10期2019年5月，题为“液质联用法同时测定人血浆中达比加群和利伐沙班的浓度”的文章使用同位素内标定量，且前处理简单，血浆样品200μL进行蛋白沉淀处理，定量下限为2ng/mL，运行时间为6min，进样量10μL。国外已报道同时测定这三种药的LC-MS/MS方法(Bioanalysis,2016,8(4),275-283)，虽然定量下限为1ng/mL，但采用固相萃取处理样本，操作繁琐，而且运行时间为10min。中国专利(CN104730165B)公开了“一种利伐沙班的高效液相色谱检测方法”，该发明分析时间8min，采用外标法定量，缺乏准确性。

总之，目前现有的方法存在操作步骤繁琐、血浆用量大、单个样品分析时间长、灵敏度低或使用外标法准确性差，检测项目单一等缺点。此外，由于临床样本极其珍贵，因此前处理样本量尽量少，且进样量过大会严重污染仪器，增加仪器维护成本。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法。

本发明的技术方案如下：

一种检测血浆中抗凝血药物浓度的方法，

所述抗凝血药物分别为：达比加群(DBT)、利伐沙班(RXB)和阿哌沙班(AXB)；

上述抗凝血药物对应的同位素内标物分别为：达比加群-13C6(DBT-13C6)、利伐沙班-d4(RXB-d4)和阿哌沙班-13C,d3(AXB-13C,d3)；

血浆样本中加入混合内标工作液涡旋均匀，加入蛋白沉淀剂，涡旋振荡，离心后取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗凝血药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗凝血药物的含量，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

流动相A：0.001％～0.01％甲酸水溶液；流动相B：流动相B为0.001％～0.01％甲酸甲醇溶液；