[发明专利]一种表达荧光素酶的高产酒克雷伯菌及其用途

说明书

本发明利用质粒构建和电转化技术，构建了含有荧光素酶基因簇(luciferase gene cassette,lux)的高产酒克雷伯菌，经自发荧光鉴定及菌株的传代稳定性试验与培养特性的观察,最终获得了可稳定表达荧光素酶的高产酒克雷伯菌(HiAlc Kpn‑LUX)。为研究产酒克雷伯菌相关疾病进展，筛选合适的杀菌方法、抗生素等提供重要的可视化研究工具。

技术领域

本发明涉及微生物医药领域，具体涉及一种含有荧光素酶基因的泛宿主质粒和稳定表达荧光素酶的基因改造的高产酒克雷伯菌的构建方法，该方法构建获得的菌株，以及该菌株在计算细菌浓度的评估方法、筛选杀菌方法、筛选药物以及制备感染动物模型等方面的用途。

背景技术

研究表明，我国约60％的非酒精性脂肪肝的发病与患者肠道中高产酒性肺炎克雷伯菌(high-alcohol-producing Klebsiella pneumoniae，HiAlc Kpn)相关。从非酒精性脂肪肝患者肠道分离的HiAlc Kpn移植至小鼠体内，结果显示，HiAlc Kpn能诱导小鼠产生非酒精性脂肪肝。对上述肠道内定植HiAlc Kpn的小鼠饲喂葡萄糖能够在小鼠的血液中检测到酒精。因此HiAlc Kpn可以作为非酒精性脂肪肝的一个新的检测指标。

目前对HiAlc Kpn诱导非酒精性脂肪肝的发病机制等研究刚刚起步，因此亟需有力工具研究HiAlc Kpn感染途径、HiAlc Kpn在体内定位和扩散的特点、评估现行抗生素使用的疗效、适合的药物，例如抗生素或其他杀菌方法的效果。

生物发光是生物体内在酶的作用下发光的现象。生物发光现象广泛存在细菌、昆虫等生物体中。利用萤光素酶基因(luciferas gene cassette，LUX)基因标记细胞的生物发光技术具有操作简便、结果直观、不依赖底物、对机体损伤小等优点。该技术已广泛应用于肿瘤生长监测和转移示踪、基因治疗、目标基因表达的检测等多个领域。

我们构建了含有萤光素酶基因LUX A/B/C/D/E的泛宿主质粒pBBR1-LUX。该质粒能够在碳青霉烯耐药克雷伯菌和产酸克雷伯菌中稳定表达荧光素酶。该质粒能够在HiAlcKpn稳定存在，并产生氯霉素耐药，但是不能表达荧光素酶。因此，需要一种改进的方法，使得高产酒性肺炎克雷伯菌能够稳定表达荧光素酶。

发明内容

为了克服上述缺陷，我们改进了pBBR1-LUX，构建时在LUX A/B/C/D/E之前添加了组成型启动子。本发明构建包含组成型启动子和萤光素酶基因LUX A/B/C/D/E基因簇的质粒，并将通过电转化至高产酒克雷伯菌，经过传代，筛选可稳定表达荧光素酶的基因改造的高产酒克雷伯菌，并将其用于计算细菌浓度的评估方法、筛选合适的杀菌方法、筛选药物以及制备感染动物模型等方面。因此，

本发明提供一种质粒，所述质粒包含组成型启动子和萤光素酶基因LUX A/B/C/D/E基因簇。

优选的，本发明构建了一个含有组成型启动子和LUX A/B/C/D/E的质粒。所述质粒为泛宿主质粒，该质粒可以在大肠杆菌中完成构建过程，其启动子能够被高产酒肺炎克雷伯菌识别。

本发明还提供一种基因改造的高产酒肺炎克雷伯菌，所述基因改造的高产酒克雷伯菌能稳定表达荧光素酶。优选的，所述基因改造的高产酒肺炎克雷伯菌能在组成型启动子的作用下稳定表达荧光素酶。

本发明还提供一种上述基因改造的高产酒克雷伯菌的构建方法，所述构建方法包括：

(1)制备包含LUX A/B/C/D/E基因簇的质粒；优选的，所述质粒为泛宿主质粒，更优选的，该质粒包含一个组成型启动子，该启动子能够被高产酒肺炎克雷伯菌识别，使得高产酒克雷伯菌能稳定表达荧光素酶，从而能检测到荧光。

(2)制备高产酒克雷伯菌的电转化感受态；