[发明专利]高效定量检测细胞外囊泡中PD-1水平的方法、ELISA试剂盒及使用方法

说明书

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种高效定量检测细胞外囊泡中PD‑1水平的方法、ELISA试剂盒及使用方法，利用抗CD63抗体、抗CD9抗体或抗CD81抗体的特异性捕获人体液的细胞外囊泡，利用抗抗PD‑1抗体检测细胞外囊泡中PD‑1蛋白水平，利用构建的对应的CD63‑PD‑1、CD9‑PD‑1或CD81‑PD‑1融合蛋白作为标准品实现对细胞外囊泡中PD‑1的定量检测。本发明实现了对细胞外囊泡这一复杂结构的定量检测；同时，通过自主构建的CD63‑PD‑1、CD9‑PD‑1、CD81‑PD‑1融合蛋白作为标准蛋白，使检测结果以具体的蛋白浓度进行表征。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-1水平的方法、ELISA试剂盒及使用方法。

背景技术

随着发病率和死亡率的不断上升，恶性肿瘤是一个重大的公共卫生问题，已经成为我国的最主要死亡原因。尽管近二十年来手术水平以及放化疗技术已经取得了长足的进步，但是恶性肿瘤的复发率和死亡率并未得到明显的缓解。肿瘤免疫治疗作为一种新兴的治疗手段，它通过重新激活人体免疫系统，使患者依靠自身免疫杀灭肿瘤细胞和肿瘤组织。自从2014年抗PD-1抑制剂首次被批准上市以来，经过多年的临床试验，靶向免疫检查点PD-L1/PD-1信号通路的免疫治疗已经证实对多种恶性肿瘤有明显的治疗效果，为晚期恶性肿瘤患者带来了希望。基于PD-L1/PD-1单抗的免疫治疗与传统的放化疗等治疗手段相比，其最大的特点在于：一旦对患者起效，其疗效显著并且持久，甚至可完全消除肿瘤达到治愈效果。然而仅有不到30％的肿瘤患者能够从价格昂贵的PD-L1/PD-1单抗治疗中获益，并且该疗法治疗周期长，一旦证实治疗无效将延误患者其他治疗的时机。因此，当前迫切需要一种寻找能够精准预测免疫治疗疗效的生物标志物。

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由细胞分泌产生的直径在50-1000nm的膜性结构的总称，其携带丰富的生物活性分子(如蛋白质、RNA等)，并可通过自分泌或旁分泌途径参与对局部或远处细胞的功能调控，影响细胞外微环境。因此检测体液中细胞外囊泡的PD-1水平，对于检测机体的免疫应答等方面具有重要的意义。

传统的酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是将可溶性的抗原或抗体结合到等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。ELISA检测是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法；由于其试剂稳定、易保存、操作简便和结果判断非常客观等因素，ELISA已广泛应用在免疫学检验的各领域中。现有的检测患者体液来源PD-1水平的ELISA策略主要是以抗PD-1抗体作为捕获抗体，同时以抗PD-1抗体作为检测抗体，形成经典“三明治夹心”结构，检测体液中总PD-1水平。由于患者体液中既存在细胞外囊泡上携带的PD-1，同时也存在大量游离的PD-1蛋白，因此直接对体液样本进行PD-1水平的ELISA定量检测将会受到游离PD-1蛋白的干扰。为了避免游离PD-1蛋白的干扰，以上策略在实际应用中需要预先利用超速离心法对体液中的细胞外囊泡进行分离和纯化。然而，超速离心法不仅耗时费力，缺乏标准化的操作流程，并且需要大型的超速离心设备，不利于临床推广应用；更重要的是，研究证实超速离心法分离细胞外囊泡的效率不足30％，这30％的细胞外囊泡中PD-1的水平能否准确反映总细胞外囊泡中PD-1水平目前仍然不清楚。因此，亟需发展一种更可靠、快速而且经济的高效定量检测体液细胞外囊泡上PD-1水平的方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-1水平的方法，避免了从体液中离心纯化细胞外囊泡这一繁琐步骤、样本回收率低的缺陷，同时还避免了游离PD-1蛋白对检测结果的干扰，实现了特异性地识别并定量检测细胞外囊泡PD-1的蛋白水平。

本发明的目的之二在于提供一种高效定量检测细胞外囊泡中PD-1水平的ELISA试剂盒，可以快速定量检测细胞外囊泡中PD-1水平。