[发明专利]一种代谢工程改造大肠杆菌制备α-酮异戊酸的方法

说明书

本发明公开了一种代谢工程改造大肠杆菌制备α‑酮异戊酸的方法，属于生物工程领域。本发明构建了一种偶联表达乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基酸脱水酶的重组菌株，并对该宿主菌株进行改造优化，获得能够发酵法高效生产α‑酮异戊酸的重组菌。该重组菌株能够以廉价的葡萄糖为底物，发酵生成附加值更高的α‑酮异戊酸，发酵36h，α‑酮异戊酸产量可达22.91g/L，葡萄糖转化率达80％。

技术领域

本发明涉及一种代谢工程改造大肠杆菌制备α-酮异戊酸的方法，属于生物工程领域。

背景技术

α-酮异戊酸(α-ketoisovalerate)是酮酸的一种，其在医药、食品、化妆品等领域都有着广泛的应用和较大的市场开发潜力。

目前，通过化学法和生物转化法可合成α-酮异戊酸，并且主要以化学合成法较为常见。然而，化学法工艺繁琐且反应条件严苛，伴随有毒副产物的产生，不适用于大规模工业生产。生物转化法以L-缬氨酸为底物在氨基酸脱氨酶和氨基酸氧化酶的催化下转化为α-酮异戊酸。利用氨基酸氧化酶法产α-酮酸在我国已实现工业化。然而，酶转化法生产α-酮异戊酸的效率都比较低且反应过程中会有H₂O₂的生成难以除去。利用发酵法生产可以有效地消除有毒副产物的产生且成本更低，更利于环保。

此外，利用大肠杆菌发酵生产α-酮异戊酸的研究很少，目前所报道的大多数是利用谷氨酸棒杆菌为宿主菌进行α-酮异戊酸的发酵积累，且大多数情况下α-酮异戊酸仅仅作为异丁醇生产过程中的副产物被积累。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种偶联表达乙酰乳酸合成酶(AlsS)、乙酰乳酸异构还原酶(IlvC)和二羟基酸脱水酶(IlvD)，利用发酵法生产α-酮异戊酸的方法，提供了一种偶联表达乙酰乳酸合成酶(来源于枯草芽孢杆菌)、乙酰乳酸异构还原酶(来源于大肠杆菌)和二羟基酸脱水酶(来源于大肠杆菌)的重组菌株，并对该重组菌株进行改造优化，获得能够高效发酵生产α-酮异戊酸的重组菌。

本发提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌偶联表达乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶和二羟基酸脱水酶。

在本发明的一种实施方式中，将EcilvC、BsalsS、EcilvD顺次连接进行表达。

在本发明的一种实施方式中，EcilvC与EcilvD添加了终止子片段EcilvC-Term。

在本发明的一种实施方式中，编码乙酰乳酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述乙酰乳酸异构还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述二羟基酸脱水酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述EcilvCNCBI上登录号为948286；BsalsS NCBI上登录号为936852；EcilvD NCBI上登录号为948277。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌沉默了支链氨基酸转氨酶B基因(ilvE)、异丙基苹果酸合酶基因(leuA)的表达；所述ilvE NCBI上登录号为948278；所述leuA NCBI上登录号为947456。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌过表达大肠杆菌来源的吡啶核苷酸转氢酶基因(pntAB)；所述pntAB NCBI上登录号为946628和946144。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌B0016-050或者大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

本发明提供了一种生产α-酮异戊酸的方法，利用所述重组大肠杆菌为发酵菌株生产α-酮异戊酸。