[发明专利]一种多重甲基化特异性PCR引物设计方法及系统

说明书

本发明公开了一种多重甲基化特异性PCR引物设计方法及系统，本发明实施步骤包括根据用户需求设置参数，对目标甲基化位点进行引物设计及筛选，然后对筛选出的多个甲基化位点引物对两两进行配对并检查兼容性，选择数量最大的可兼容的多重引物组合，最后对设计完成的多重引物组合进行评价，并决定是否需要重新设计引物。本发明能实现超长长度序列的多重甲基化特异性PCR引物设计，能有效减少单对引物内部之间和多对引物之间dimer/hairpin等二级结构的出现以及在基因组中的非特异性扩增，设计出的引物特异性强，提高了多重甲基化特异性PCR实验测试过程的可操作性和准确度，同时大大提高了工作效率。

技术领域

本发明涉及DNA甲基化检测领域，尤其涉及一种多重甲基化特异性PCR引物设计方法及系统。

背景技术

人类表型与人类基因组突变的关系自人类基因组计划等研究开展以来逐步变得清晰。在2015年约有8800万个突变(8470万个单核苷酸突变、360万个短片段插入或缺失)以及6个结构变异已经被鉴别。2001年人类医学遗传学在线数据库中(OMIM^TM)已经有13005个条目是关于人类基因组突变与人类疾病的相关研究结果。人类基因组突变已经逐渐应用于人类生活中，例如药物指导、药物耐药性检测、产前检测以及肿瘤检测等领域。

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传包括有DNA甲基化(DNA methylation)、基因组印记(genomic imprinting)、基因沉默(gene silencing)、核仁显性、休眠转座子激活和RNA编辑(RNA editing)等。研究表明，表观遗传学生物学标记也可以作为疾病的指标，提示疾病风险或人体的健康状态。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化标记已经广泛应用于医学及健康领域。卢煜明等人利用胎儿染色体21上的某些CpG岛显示与位于母体染色体21上相应CpG岛不同的甲基化模式，在胎儿出生前提前检测胎儿是否患有21号染色体三体综合征(先天愚型)(CN101535502A)。此外，Septin9基因甲基化检测已经被认定为肠癌筛查的金标准(CN201810326484.7，CN108048570A，CN105861672A，CN201610948298.8，CN201710285809.7)。随着人类以及其他生物的全基因组甲基化测序以及全基因组甲基化图谱的广泛开展，越来越多甲基化位点被鉴别为临床或生物学表型特异性位点。癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)计划已经完成了约11000多个样本、30多种癌症的全基因组甲基化图谱，每种癌症都存在大量临床意义的甲基化位点可以用来指导肿瘤的检测以及预防。

甲基化位点的检测方法包括全基因组测序、全基因组甲基化图谱、多基因甲基化捕获测序、荧光定量PCR、甲基化特异性PCR以及甲基化扩增产物测序等。但是，全基因组测序、全基因组甲基化图谱、多基因甲基化捕获测序方法是针对超过1000个以上甲基化位点的检测；而荧光定量PCR、甲基化特异性PCR以及甲基化扩增产物测序等方法是针对于1～2个目标甲基化位点进行检测，目前的DNA甲基化特异性PCR引物设计软件MethPrimer、Methyl Primer Express工具都是针对单位点进行引物设计的。因此，目前多个甲基化位点的检测需要针对多个目标片段设计大量引物，经过多次实验反复筛选才有可能实现，工作量大，耗时长。多重甲基化特异性PCR不但能减少实验量、提高工作效率，还能降低样本量需求，提高技术可行性。然而，由于基因组DNA通过亚硫酸盐转换后，未甲基化C转换为T，基因组复杂性降低，导致引物复杂性降低，引物二聚体、二级结构以及非特异性扩增增加，更加增加了多重甲基化特异性PCR引物设计的难度，并且常规的普通多重PCR引物设计软件无法适用于多重甲基化特异性PCR引物设计。目前，缺乏一种能够针对多个甲基化位点，设计多重PCR引物，并保障单对引物内部之间以及多对引物之间的无dimer/hairpin等二级结构、在基因组中特异性扩增的系统和方法。

发明内容