[发明专利]常温等温快速检测副溶血弧菌的引物、探针、试剂和方法

说明书

本发明适用于副溶血弧菌检测技术领域，提供了一种常温等温快速检测副溶血弧菌的引物和探针。本发明还提供一种包括上述引物和探针的常温等温快速检测副溶血弧菌的试剂和方法。本发明可以在常温等温条件下，对副溶血性弧菌进行快速、实时、特异性检测。通过特异性引物、特异性荧光探针、4种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。

技术领域

本发明涉及副溶血弧菌检测技术领域，尤其涉及一种常温等温快速检测副溶血弧菌的引物、探针、试剂和方法。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)隶属弧菌科，弧菌属，革兰阴性嗜盐菌，多形态杆菌或稍弯曲弧菌，1950年，被日本Fujino等学者首次分离得到，命名为副溶血性溶血巴斯德氏菌。1955年，Takikawa等由于发现它具有耐盐性，鉴定为嗜盐菌，直至1963年Sakazaki等将其定名为副溶血弧菌。

副溶血性弧菌为多形态菌，常见的有弧状、卵圆状、棒状或丝状，多为不规则分布，偶尔成对，有鞭毛，不产芽胞与荚膜。该菌长约1.4-2.4μm，宽约0.5-0.8μm。副溶血性弧菌有两种鞭毛形式：丛生鞭毛和单端鞭毛。能够在0.5～8.0％盐度和5～44℃范围内生长，其最佳生长盐度和温度分别为3％和35℃。最佳生长pH为7.7。根据抗原结构可将副溶血性弧菌分为13个群(O抗原)和65个型(K抗原)。由于该菌是一种嗜盐性菌，在无盐环境下不能生长。因此副溶血性弧菌一般存在于海产品中。

副溶血性弧菌中的致病性基因—耐热直接溶血素(tdh)和溶血相关的溶血素(trh)被确认为主要的毒力基因。其中，tdh具有直接的溶血活性，它可以使多种哺乳动物的红细胞发生溶血现象，能够破坏溶酶体和细胞膜，并在细胞膜上形成小孔通道使细胞内外离子浓度发生不正常的变化，从而使细胞发生病理和形态学的改变，进而导致细胞的膨胀甚至死亡。trh具有与tdh相似的免疫原性和生物活性，也会导致相似的生理学病变，故将其命名为耐热直接溶血相关毒素。

副溶血弧菌广泛分布于沿海国家和地区和河口海区的海水以及鱼、虾、蟹、贝类等生物体中，其致病性受宿主的生理状及水体环境条件等综合因素的影响较大，主要通过消化道感染，属于肠道条件致病菌的一种。病人主要通过食用生的或未充分加热的海产品而出现恶心、呕吐、腹泻、发热等胃肠炎反应，严重者可引起全身痉挛、脱水、循环系统衰竭、败血症等症状而致死亡。

目前对副溶血性弧菌检测的方法：细菌培养法、显色培养法、免疫学方法、多管发酵法、核酸扩增检测法、核酸杂交法等。分子生物学检测方法可以快速准确的进行病原体检测，可用于VP的诊断，目前国内外已经建立了一些VP的检测方法。例如：IgM捕获和IgGELISAs技术，PCR技术，套式PCR技术，LAMP技术等等。这些技术耗时相对较长，而且对副溶血弧菌检测的灵敏度上有待进一步优化。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种常温等温快速检测副溶血弧菌的引物、探针、试剂和方法，其可以常温等温条件下，对副溶血性弧菌进行快速、实时、特异性检测。

为了实现上述目的，本发明提供一种常温等温快速检测副溶血弧菌的引物和探针，上下游引物和探针的序列具体如下：

上游引物VP-4-F：CAACGACGCAGCAATGCAGCCAGATCAAATCAAC

下游引物VP-4-R：GTAAACAAGGTGTTTGCTGGTTTGTAGTTCTTC

探针VP-Probe：

CATCACAATGGCGCTTCCCTAACCCGAACAGC(F)G(H)(B)TCTTAGGTCACTTCTC—SpacerC3。