[发明专利]心肌细胞的分离试剂和分离方法

说明书

本发明涉及用于哺乳动物的心肌细胞、特别是人心肌细胞的分离试剂和分离方法。具体地，本发明涉及一种心肌细胞分离方法，其包括以下步骤：预处理步骤，清洗脱钙步骤，消化步骤，平衡步骤，滴液复钙步骤，其中，所述各步骤中所使用的至少一种操作液中含有BLEB和/或PAB或其生理学上可接受的盐。由此，本发明可以显著减少心肌细胞分离的操作时间，同时提高所分离细胞的活率和质量。

本申请所涉及的科研项目系中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目，项目编号为2017-I2M-1-003。

技术领域

本发明涉及用于哺乳动物的心肌细胞、特别是人心肌细胞的分离试剂和分离方法。

背景技术

为了研究细胞的生理学特性以及各种因素(包括药物作用)对于细胞的影响，从而满足科学研究和新药开发等方面的需求，常常需要从活体组织中将单个的细胞提取分离出来。一般而言，细胞分离技术包括机械分散法和消化分离法。其中，机械分离法适用于纤维成分较少的组织，如脑组织或部分胚胎组织；消化分离法则是采用酶或非酶消化的方法将细胞间的纤维组织、结缔组织等进行消化，从而使细胞彼此分离的方法。在采用酶的消化分离法中，常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶(例如II型胶原酶)等。

心肌细胞的分离，对于心血管疾病相关的临床和药理研究而言也是十分重要的。心血管疾病是人类健康最大的杀手之一，《中国心血管病报告2018》显示，由心血管疾病导致的死亡占因病死亡总数的40％以上，高于肿瘤及其他疾病(非专利文献1)。因此，心血管疾病的防治对人类健康而言至关重要，而心肌细胞、特别是人心肌细胞对于心血管疾病防治的科学研究的重要性自然不言而喻。然而，相比于其它体细胞，心肌细胞本身具有运动性强、耗氧高、不易存活的特点，加大了心肌细胞的分离难度，分离后的心肌细胞存活率低，难以满足科研和临床研究的需要。

目前最常用的哺乳动物心肌细胞分离方法是离体灌流法，即取出心脏后再用酶消化的方法将心肌细胞分离。但这种方法对于人类心肌细胞而言并不现实，因此在目前对人类心肌细胞的初步研究中，往往都是先采取机械剪碎的方法进行物理分离，然后再进行消化，以下简称“传统消化法”。

在传统消化法中，通常的程序如下：组织转运及切片，氧合，脱钙，消化，复钙。其中，“组织转运及切片”即通过机械方法将心肌组织进行剪碎，并保存于保存液中的操作。在本说明书上下文中，“氧合”或“氧合步骤”指向保存液中添加氧气，以使氧浓度接近心脏中氧浓度的操作；“脱钙”是指降低细胞内的钙离子浓度的操作，其作用是消除钙离子的存在对于消化过程的影响，常用的方法是所谓的“梯度脱钙法”。在本说明书上下文中，“梯度脱钙法”或“梯度脱钙步骤”是指将细胞浸泡于无钙液中使钙离子流出，弃去无钙液后再换用新的无钙液，如此重复多次后使得钙离子逐渐被稀释而实现脱钙操作。“消化”是指使用酶将细胞间的间质成分消解，使单个的细胞从组织中脱离出来的步骤。“复钙”是指恢复细胞内的钙浓度，使之能够正常进行新陈代谢的操作，常用的方法是“梯度离心复钙法”，即多次(一般为5次以上)添加不同浓度梯度的复钙液(无钙液+不同浓度氯化钙)，每次添加复钙液之后进行离心，然后再添加下一钙浓度梯度的复钙液进行复钙。

在上述步骤中，本领域技术人员普遍认为氧合非常关键的步骤，其作用是确保无钙台试液中的氧浓度与心脏中保持一致，有助于细胞存活。然而，正常在体心脏所接触到的氧气含量约为5％，远比空气中氧含量低，而为危重病人提供氧气量约为每分钟10-15升，正常情况下，输送的氧气仅有25％会被利用。并且，加氧后配制消化酶液和复钙液的步骤为开放操作，由于不可避免要与外界环境接触，导致氧气含量极易降回到氧合前的水平。因此，事实上添加氧气的步骤无法从根本上改善细胞分离过程中的存活率。此外，氧合步骤需要使用氧气钢瓶，这会带来潜在的危险性。