[发明专利]一种基于DNA微条形码技术的有毒鹅膏菌物种鉴定方法及应用

说明书

本发明涉及食品质量安全检测技术领域，具体公开了一种基于DNA微条形码的鹅膏菌属物种鉴定方法及应用。该方法通过提取有毒鹅膏菌基因组DNA，然后利用自主设计的DNA微条形码引物进行PCR扩增，将纯化后的PCR产物进行测序，将测序所得的DNA微条形码片段序列与公共数据库中的参考序列进行比对，根据序列的匹配相似度进行物种鉴别。本方法操作简便，准确性高，能够鉴别出人工模拟消化后的鹅膏菌样品，在分析鹅膏菌或误食后的呕吐物等场景中具有较大的应用潜力。

技术领域

本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体而言，涉及一种基于DNA微条形码技术的有毒鹅膏菌属物种鉴定方法及应用。

背景技术

鹅膏菌属隶属于真菌界（Fungi）、担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目（Agaricales）、鹅膏菌科（Amanitace），是大型真菌中分布较广的大属。全世界报道且被验证的鹅膏菌有近500种，我国报道的有130多种（亚种、变种及变型）。在这些鹅膏菌中，既有可食用的鹅膏菌，如橙盖鹅膏菌(Amanita caesarea)、卵盖鹅膏菌(Amanita ovoidea)、红黄鹅膏菌(Amanita hemibapha)等，也有含毒的鹅膏菌，如锥鳞白鹅膏菌（Amanita virgineoides）、小毒绳鹅膏菌（Amanita melleiceps）、鳞柄白鹅膏菌(Amanita virosa)。鹅膏菌属多分布于林地边缘或林中透光多的地方，在灌木丛或者树木茂密的地方则分布较少，在我国主要分布于亚热带地区，如广州、湖南、云南、山东等地；少数分布于我国温带或热带地区，如海南的灰盖粉褶鹅膏（Amanita griseorosea）、假褐云斑鹅膏菌（Amanita pseudoporphyria）等。据统计，贵州省2012-2016年期间每年由野生毒蕈中毒引起的死亡数均占当年总死亡数的50%以上，2016年占比最高达94.44%，其中大多数病例是由于食用鹅膏菌属引起的，如致命鹅膏（Amanita exitialis）、淡红鹅膏（Amanita pallidorosea）、假淡红鹅膏（Amanita subpallidorosea）等。据不完全统计，我国2019年共发生了53起蘑菇中毒事件，其中有36起事件成功鉴定出了具体的毒蘑菇种类，主要是灰花纹鹅膏（Amanita fuliginea）、裂皮鹅膏（Amanita rimosa）以及大青褶伞（Chlorophyllum molybdites）；27起（占49.09%）事件未能鉴定出毒蘑菇种类。

DNA条形码（DNA Barcoding）技术是利用一段标准的、较短的DNA序列作为分子标记，通过对生物体中一个或多个基因进行扫描，从而实现物种鉴定的技术。目前DNA条形码技术已经广泛应用于生物的分类和鉴定，是一种简便、高效、准确的物种鉴定技术。内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）是18S-26S的核基因组DNA的内转录间隔区部分相对保守的片段区域，含有许多高度可变的无义序列，在进化过程中承受的自然选择压力较小，变异程度高，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，是真菌界中是最常用的DNA条形码。但是在一些加工食品中，由于其DNA遭到破坏，导致无法提取到完整的ITS基因，此时提取到部分ITS基因（100 bp-400 bp）也可以准确鉴定物种。