[发明专利]一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法

权利要求书

1.一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、预热：

将基础培养基倒入离心管中，预热到37℃，静置待用；

S2、解冻：

将装有脂肪来源种子间充质干细胞冻存管从液氮罐中取出进行解冻；

S3、混合：

将解冻后的脂肪来源种子间充质干细胞用移液枪吸取至装有基础培养基的离心管中；

S4、离心：

将脂肪来源种子间充质干细胞和基础培养基的离心管放入离心机，1000-2000rpm离心5-10min；

S5、再混合：

将血清替代培养基倒入离心后的离心管中并混匀，得到细胞悬液；

S6、培养：

将血清替代培养基倒入培养瓶中，吸取S5中的细胞悬液接种至培养瓶中，并按照5000-10000/cm²的细胞密度用血清替代培养基放置在37℃、5%-7%的CO₂培养箱静置培养24小时后，更换血清替代培养基继续培养至细胞融合度达到85%；

其中，步骤S5中的血清替代培养基的制备过程为：将传代至P4代的脂肪来源间充质干细胞按照7000-10000/cm²的细胞密度用含体积分数为0.03%肝素钠的MSCBM的培养基培养24h；用平衡缓冲液清洗后，再用无血清培养基培养，分别在培养24h、48h、72h时收集培养基上清，1000-2000rpm离心5-10min，去除沉淀，收集所有上清混合，滤膜过滤后获得血清替代培养液；将血清替代培养液与基础培养基混合制得血清替代培养基，其中血清替代培养液占比4%-8%。

2.根据权利要求1所述的一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，步骤S2中的解冻过程为：将冻存管在39℃的水浴中解冻1-2min，再将冻存管转移至37℃的水浴中解冻3-4min。

3.根据权利要求1所述的一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，在血清替代培养基的制备过程中，分别用无血清的DEME培养基培养24h、无血清的MSCBM培养基培养48h、无血清的DEME培养基：无血清的MSCBM培养基为1:1的培养基培养72h。

4.根据权利要求1所述的一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为Hanks平衡缓冲液。

5.根据权利要求1所述的一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，步骤S4中，离心转速为1500rpm，离心时间为5min。

6.根据权利要求1所述的一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，步骤S6中，细胞密度为7500/cm²。

7.根据权利要求1所述的一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，步骤S6中，培养箱的培养条件为37℃、6%CO₂。