[发明专利]一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法，S1、预热；S2、解冻；S3、混合：将解冻后的脂肪来源种子间充质干细胞用移液枪吸取至装有基础培养基的离心管中；S4、离心：将脂肪来源种子间充质干细胞和基础培养基的离心管放入离心机，1000‑2000rpm离心5‑10min；S5、再混合：将血清替代培养基倒入离心后的离心管中并混匀，得到细胞悬液；S6、培养：将血清替代培养基倒入培养瓶中，吸取S5中的细胞悬液接种至培养瓶中，并按照5000‑10000/cm²的细胞密度用血清替代培养基放置在37℃、5%‑7%的CO₂培养箱静置培养24小时后，更换血清替代培养基继续培养至细胞融合度达到85%。本发明具有提高复苏细胞活力的特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法。

背景技术

近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究者们的热点。间充质干细胞可以分泌多种具有生物活性的细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。将细胞因子添加到美容化妆品，不仅具有一般化妆品的保湿美白功效，还能够修复受损皮肤，消除皮肤皱纹，收缩毛孔，改善面色等，越来越受到人们的关注。

现有中国专利申请公布好为：CN110317781A的专利文件公开了一种间充质干细胞冻存和复苏的方法，其所公布的用于间充质干细胞冻存和复苏的细胞冻存液，包含65份DMEM-F-12、10份二甲基亚砜、15份犬血白蛋白、0 .04％w/v泊洛沙姆188和0 .6％w/v组氨酸，其将间充质干细胞与细胞冻存液混合均匀，接着将该细胞液置于液氮中冷冻，冻存直至细胞的使用；待需要使细胞复苏时，将冻存的细胞从液氮中取出，迅速投入37℃水浴中，在1～5min内使冻存液完全融化，细胞融化后即转移至4℃冰浴上，完成细胞复苏。

上述间充质干细胞的复苏过程中使用的冻存液包含犬血白蛋白，而犬血白蛋白批次间的差异波动，成分不明确，来源不稳定等各种原因，不可避免地会对培养液产生污染和对细胞具有毒性作用，细胞培养的失败率高，实验结果可靠性差。

又有文献《冻存复苏后骨髓间充质干细胞体外扩增和多向分化潜能研究》(浙江大学学报工学版，第40卷第11期，2006年11月)记载了当前复苏骨髓间充质干细胞的普遍方法：在复温时从液氮中取出样品立即放入37℃水浴锅内摇动冻存管，1-2min后复温完毕，加入新鲜的培养液(含体积分数为10％的FBS的α-MEM培养液)400g离心5min，弃上清液，加入新鲜培养液放入CO2培养箱中培养。待细胞达到80％-90％融合后，用消化液消化并以1∶3传代进一步扩增。

但是该方法使用新鲜的培养液(含体积分数为10％的FBS的α-MEM培养液)，也添加有胎牛血清FBS，同样地，胎牛血清FBS批次间的差异波动，成分不明确，来源不稳定等各种原因，不可避免地会对培养液产生污染和对细胞具有毒性作用，复苏后的细胞活力偏低，不利于后续的进行组织器官损伤修复等临床应用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法，其具有提高复苏后细胞活力的特点。

为实现上述目的，本发明提供了一种脂肪来源间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：

S1、预热：

将基础培养基倒入离心管中，预热到37℃，静置待用；

S2、解冻：

将装有脂肪来源种子间充质干细胞冻存管从液氮罐中取出进行解冻；

S3、混合：

将解冻后的脂肪来源种子间充质干细胞用移液枪吸取至装有基础培养基的离心管中；

S4、离心：