[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法在审
| 申请号： | 202010484307.9 | 申请日： | 2020-06-01 |
| 公开（公告）号： | CN111607569A | 公开（公告）日： | 2020-09-01 |
| 发明（设计）人： | 秦乐;吴迪;蒋治武;其他发明人请求不公开姓名 | 申请（专利权）人： | 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/90 |
| 代理公司： | 北京品源专利代理有限公司 11332 | 代理人： | 巩克栋 |
| 地址： | 510663 广东省广州市高新技术产业开发区科学城揽月路*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 crispr cas9 编程 itnk 细胞 方法 | ||
1.一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法，其特征在于，所述方法通过电转化将RNP复合物转入激活的T细胞中，得到所述ITNK细胞；
所述RNP复合物包括crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的总摩尔量与Cas9蛋白的摩尔量比为1:(1～5)；
优选地，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的摩尔量比为1:(0.8-1.2)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RNP复合物的摩尔浓度为40～120μM；
优选地，电转时所述RNP复合物与细胞的使用量比例为(2～100)μL:106个细胞。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述crRNA的核苷酸序列如SEQID NO.7～12所示；
优选地，所述tracrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述crRNA的靶基因包括Bcl11b基因。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述电转化的电压为1.5～2.5kV，时间为3～5ms。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于，所述电转化结束后，所得细胞悬液置于完全培养基中培养；
优选地，所述完全培养基包括T551-H3完全培养基。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，所述T细胞采用Ficoll密度梯度离心法进行分离；
优选地，所述T细胞采用磁珠分选方法进行分选。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白制成RNP复合物，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的总摩尔量与Cas9蛋白的摩尔量比为1:(1～5)，所述RNP复合物中crRNA和tracrRNA的摩尔量比为1:(0.8-1.2)，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12所示，所述tracrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13～14所示，所述crRNA的靶基因为Bcl11b基因；
(2)采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血得到外周血单个核细胞，采用磁珠分选方法进行分选得到T细胞，并激活所述T细胞；
(3)将步骤(1)所述的RNP复合物电转入步骤(2)所述激活的T细胞中，再转入完全培养基中培养，培养18～24小时后，更换新鲜的完全培养基继续培养，得到所述ITNK细胞。
10.如权利要求1～9任一项所述的方法制备得到的ITNK细胞。
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