[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法

说明书

本发明提供一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法，所述方法通过电转化将RNP复合物转入激活的T细胞中，得到所述ITNK细胞。所述方法将RNP复合物通过电转的方法转入T细胞中，使其分化成为ITNK细胞，所述方法能够提高体外重编程效率，且得到ITNK细胞具有较好的体外扩增能力，在电转后第14天，其细胞扩增倍数为26.8～62.2倍，且所述ITNK细胞具有较强的体外杀伤功能。本发明提供的方法能够整体提升重编程ITNK细胞的制备能力，使更多临床患者获益。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法，尤其涉及一种基于CRISPR/Cas9重编程ITNK细胞的方法。

背景技术

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，规律成簇间隔短回文重复系统)，CRISPR/Cas是一种具有核酸内切酶活性的复合体，其中Cas是CRISPR相关的蛋白质。CRISPR/Cas能够识别特定的DNA序列，进行特定位点切割造成双链DNA断裂(Double-strand breaks，DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ),造成移码突变(frameshift mutation)，导致基因敲除。

CRISPR/Cas系统是一种原本存在于自然界原核生物中的免疫防御系统，用来抵抗噬菌体或者病毒等外来遗传物质的入侵。它为细菌提供了获得性免疫(类似于哺乳动物的二次免疫)，当细菌遭受病毒入侵时，会产生相应的“记忆”。当病毒二次入侵时，CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，使外源基因的表达沉默，从而达到抵抗病毒干扰的目的。

由于CRISPR/Cas系统精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在CRISPR/Cas系统中，CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种。其中，Cas9靶向切割DNA是通过两种小RNA：crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)和靶序列互补识别的原理实现的。目前，已经能够将这两种小RNA融合成一条RNA链，简称sgRNA(single guide RNA)。不过，尽管这种技术已经成功应用于多种细胞系，它对原代细胞的编辑效率却非常低，严重限制了CRISPR技术在原代细胞上的应用。

T细胞是适应性免疫系统中非常重要的调节和效应细胞，近年来基于T细胞的免疫治疗技术受到了越来越多的关注。同时，人们也在不断尝试对T细胞进行基因编辑以研究其激活分化机制或者增强其抗肿瘤功能。Li等人在2010年首次提出且成功将小鼠T细胞重编程成NK样细胞(induced T-to-natural killer cells，ITNK细胞)(具体参见Li,P.etal.Reprogramming of T cells to natural killer-like cells upon Bcl11bdeletion.Science 329,85-89(2010).)，并于近年采用CRISPR/Cas9技术成功地将人T细胞重编程成为ITNK细胞。

为进一步提高重编程效率，有研究者尝试将Cas9和gRNA通过病毒载体或者电转的方式对原代T细胞进行基因编辑，但是打靶效率非常低，而且直接电转DNA会对T细胞造成较高毒性。还有研究者尝试电转Cas9和体外转录或合成的单链gRNA的复合物来提高对原代T细胞的编辑效率(参见Rutz,S.Seki,A.Optimized RNP transfection for highlyefficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.Journal ofExperimental Medicine 215,985-997(2018).)。但是，使用CRISPR/CAS9技术重编程ITNK细胞仍然面临效率低且毒性大等问题。