[发明专利]一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备矮小型转基因鸡的sgRNA和制备方法

权利要求书

1.一种精子载体技术在制备转基因鸡受精蛋中的应用，其特征在于，具体包括：

根据靶基因设计sgRNA中的crRNA序列，根据所述crRNA序列构建sgRNA与Cas9蛋白的共表达质粒；所述sgRNA中的crRNA部分的编码链和互补链序列如SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6中任一对人工序列所示；

采集鸡的精子，将所述共表达质粒与所述精子共同孵育，获得携带共表达质粒的精子，然后人工授精，获得受精蛋；

所述共表达质粒的制备方法为：将所述crRNA的编码链和互补链在合成相应的DNA单链时5´端添加与BbsI限制性内切酶线性化后的pX330质粒的粘性末端相匹配的粘性末端序列，然后两条互补单链经退火形成双链DNA；用BbsI限制性内切酶线性化pX330质粒，形成5´突出的粘性末端；将退火形成的所述双链DNA与线性化后的pX330质粒用T4 DNA连接酶连接，得到所述共表达质粒；

所述共同孵育的方法为：

采集新鲜公鸡精液，悬浮于M199培养基混匀洗涤精浆，加入M199培养基作为孵育液，并加入所述共表达质粒和脂质体，混匀，共同孵育，获得携带共表达质粒的精子；所述脂质体相对于精液的浓度为5~7.5μl/ml；共同孵育的时间为10~60min，温度为37℃。