[发明专利]一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备矮小型转基因鸡的sgRNA和制备方法

说明书

本发明涉及转基因动物技术领域，具体涉及一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备转基因鸡的sgRNA和制备方法。该方法根据用于制备sgRNA的crRNA编码序列构建sgRNA与Cas9蛋白构建出共表达质粒，以精子为载体制备转基因动物。该方法通过精子载体与第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9的结合，使转基因动物的制备过程操作简单，成本低，效率高，既能够用于转基因禽类动物的制备，也可以用于其他有性繁殖的转基因动物的制备。

技术领域

本发明涉及转基因动物技术领域，具体涉及一种精子载体制备转基因动物的方法以及一种制备转基因鸡的sgRNA和制备方法。

背景技术

转基因技术是指事先进行设计，然后通过一定的方法对目标物种按设计的方案进行遗传修饰，使目标物种基因型和表型发生改变，而且这种改变可稳定的遗传给后代的一项生物技术。因此转基因技术可以打破物种间的生殖隔离，实现定向诱导培育，进而大幅缩短育种时间。动物转基因技术目前主要应用于动物改良、新品种的培育、特殊疾病模型的建立、特定基因的功能性研究、疾病的基因治疗、生物生长发育调控、制造具有生物活性的产品。

动物转基因技术对畜禽育种具有重要意义。如，转基因鸡技术能够改善鸡的遗传性状，可用于改善肉品质、提高鸡的饲料转化率、提高产蛋率、提高个体自然抗病能力等。但目前制备转基因动物的技术普遍存在操作复杂、成本高的问题，外源基因随机整合还有导致内源基因突变的可能，且经常使用的病毒载体还存在潜在的致癌风险而导致生物安全问题。早期建立的精子载体法制备转基因动物的方法虽然具有操作简单成本低廉的优点，但存在外源基因不能整合到受体基组中而导致很难获得能够稳定遗传的转基因动物个体的问题。而且由于禽类特殊的生理结构，制备转基因哺乳动物的已经比较高效成熟的技术往往在应用于家禽上时面临种种挑战，无法推广用来制备转基因禽类，致使转基因家禽的制备技术还不够成熟。

基因编辑技术可有针对性的对特定基因位点进行修饰导致插入、缺失、碱基序列改变等突变，是转基因动物研究的重要方法之一，目前主导的基因编辑技术包括锌指蛋白核酸酶（Zinc- fingernucleases，ZFNs）、转录激活因子样效应核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs）和通过sgRNA引导的CRISPR/ Cas9 核酸酶。锌指核酸酶和TALEN技术十分繁琐费力，操作过程相当复杂。相较于ZFNs和TALENs，CPISPR/Cas9核酸酶成本低、制作简单、实验周期短、作用更加高效、靶点分布广且可以同时对多个基因进行编辑。但CRISPR/Cas9系统虽然能够高效快速地实现基因编辑，却需要进入靶细胞才能发挥作用。

发明内容

针对现制备转基因动物的技术普遍存在操作复杂、成本高，而且转基因动物制作中外源基因的随机整合有导致内源基因突变的可能，经常使用的病毒载体又存在潜在的致癌风险而导致生物安全的问题，精子载体法制备转基因动物外源基因不能整合到基因组以及CRISP/Cas9系统需要进入靶细胞才能发挥作用等问题，本发明提供一种精子载体制备转基因动物的方法。

以及，本发明还提供精子载体制备矮小型转基因鸡的sgRNA。

以及，本发明还提供精子载体制备矮小型转基因鸡的sgRNA与Cas9蛋白共表达质粒。

以及，本发明还提供矮小型转基因鸡的制备方法。

为实现上述目的，本发明实施例提供了精子载体制备转基因动物的方法，具体包括：

根据靶基因设计sgRNA的crRNA序列，根据所述crRNA序列构建所述sgRNA与Cas9蛋白的共表达质粒；

采集动物的精子，将所述共表达质粒与所述精子共同孵育，然后人工授精，获得受精卵，培育所述受精卵获得所述转基因动物。