[发明专利]不动杆菌苯酚羟化酶基因、其编码蛋白及其克隆方法和载体、宿主细胞

说明书

本发明涉及一种不动杆菌苯酚羟化酶基因、其编码蛋白及其克隆方法和载体、宿主细胞。本发明基因来源于不动杆菌属细菌，为SEQ ID NO1所示的碱基序列。该基因编码苯酚羟化酶，能够在大肠杆菌中发挥苯酚羟化酶的功能，能使大肠杆菌实现降解苯酚的能力，同时也预示了它在其他生物降解苯酚利用方面的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种不动杆菌苯酚羟化酶基因、其编码蛋白及克隆方法，应用于好氧降酚微生物及酚类化合物有机污染物治理技术领域。

背景技术

酚类化合物是一种常见的水溶性有机污染物，广泛存在于石油、化工、煤气、焦化、钢铁及酚类生产厂排放的废水中，有毒且难降解。含酚污水不经过处理而任意排放会污染生态环境。因此，酚类化合物及其衍生物被我国等一些国家列入优先控制的污染物。

苯酚是典型的酚类有机物之一。苯酚的微生物降解法在效率、投资和二次污染等方面相对化学降解法有明显的优越性。从自然和人工环境中已鉴定并分离到大量的好氧降酚微生物，它们的多样性非常广泛，包括假单胞菌属、芽胞杆菌属、产碱杆菌属、酵母菌属、丛毛单胞菌属、罗尔斯通菌属、不动杆菌属、伯克雷氏菌属等，关于这些菌降解苯酚的生理生化特性已有不少的研究报道。

细菌对苯酚好氧降解的代谢途径目前已有完整解析，第一步是苯酚加氧生成邻苯二酚，由苯酚羟化酶(phenol hydroxylase)负责催化，然后邻苯二酚再分别经邻位和间位开环裂解，进一步生成β-酮基己二酸和α-酮基己二酸等中间产物，该两类化合物均为生物体内三羧酸循环过程的中间产物。整个好氧降解苯酚途径中，第一步反应是限速步骤。因此，苯酚羟化酶的活性将决定细菌对苯酚的降解利用能力，其编码基因是整个降酚基因簇上的关键基因，研究该基因的结构和功能具有重要的理论和应用双重价值。

不动杆菌(Acinetobactersp.)是一种常见的土壤细菌，在富含酚类废水污染的河道污泥中广有分布，表明其具有良好的苯酚利用能力。对这类细菌进行苯酚羟化酶基因的克隆及功能鉴定，将有助于发现新型降酚基因并应用于微生物代谢工程，指导生物强化和生物修复策略，为今后改善环境污染问题提供良好的科学依据，这成为亟待了解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种不动杆菌苯酚羟化酶基因、其编码蛋白及其克隆方法和载体、宿主细胞，该基因编码苯酚羟化酶能够在大肠杆菌中发挥苯酚羟化酶的功能，能使大肠杆菌实现降解苯酚的能力，同时也预示了它在其他生物降解苯酚利用方面的应用价值。

为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：

一种不动杆菌苯酚羟化酶基因，该基因的序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

一种本发明不动杆菌苯酚羟化酶基因编码的蛋白，其蛋白的序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一种重组表达载体，含有本发明不动杆菌苯酚羟化酶基因。

一种宿主细胞，该宿主细胞含有本发明重组表达载体。

一种不动杆菌苯酚羟化酶基因的克隆方法，步骤如下：参考NCBI数据库中的不动杆菌属细菌的苯酚羟化酶基因的序列，设计了特异引物，从自行保藏的不动杆菌细菌菌株基因组DNA 中扩增，得到苯酚羟化酶基因；

所述引物为：BP1F:5’-ATGACTTTAGAAATTAAAAC-3’和BP1R:5’-TTATATCGCGGCGTCGCAGC-3’。

优选上述PCR扩增的条件为：94℃，5分钟；94℃，50秒，53℃，50秒，72℃，1分10 秒，28个循环；72℃8分钟。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：