[发明专利]一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法

权利要求书

1.一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、肥大细胞分离

去除离体皮肤上粘附的脂肪组织，剪成块，移入含中性蛋白酶、Ca²⁺和Mg²⁺的PBS中，4-6℃下孵育过夜；

去表皮，继续剪碎皮肤，将剪碎的皮肤转移到含酶合剂的培养基中，振荡孵育1-1.5h；

过滤皮肤和酶合剂，并于4-5℃条件下离心；

加入AB血清和静脉免疫球蛋白，加MACS缓冲液至1-2mL，4-5℃下孵育10-15min；

添加CD117免疫磁珠，4-5℃下孵育10-15min；

洗涤细胞，离心，沉淀重悬于缓冲液中；

运行免疫磁珠细胞分选系统，分选出肥大细胞及其他阴性细胞；

步骤二、肥大细胞活化

将步骤一所得样本在室温下离心，收集肥大细胞，洗涤后悬于Tyrode's台式液/0.1％BSA中；

在恒温箱中用待测患者血清孵育肥大细胞1.5-2.5h，随后用Tyrode's台式液/0.1％BSA洗涤；

为进行过敏原刺激，将活化的肥大细胞重悬于Tyrode's台式液/0.1％BSA中，孵育30-45min；

步骤三、组胺检测

步骤二所得活化的肥大细胞混悬液滴在涂有过敏原提取液的玻璃微纤维微量滴定平板上，经孵育、洗涤、加SDS孵育、洗涤、耦合后进行荧光检测，定量计算组胺释放量并判断患者的过敏程度。

2.根据权利要求1所述的一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法，其特征在于，步骤一中，使用剪刀或手术刀从离体皮肤上去除所有粘附的脂肪组织，再无菌称量皮肤，随后将皮肤放在不添加PBS的培养皿中，剪成1cm×1cm的小块，使用手术刀以1-2mm的间隔以编织筛面状切割，孵育后使用镊子去除表皮未分离的碎片，以去除CD117⁺黑色素细胞。

3.根据权利要求1所述的一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法，其特征在于，步骤一中，过滤皮肤和酶合剂的步骤为：

将溶液在两个筛网中过滤，上层筛网孔径300μm，底层筛网孔径100μm，以去除皮肤残留物；将溶液分配到50mL的Falcon管中；于4-5℃、离心力400g条件下将滤液离心10-15min；倒出上层的酶合剂并收集，供未滤过的剩余皮肤再次使用；将没滤过的剩余皮肤重新修剪，放入酶合剂中水浴45-75min。

4.根据权利要求1所述的一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法，其特征在于，过滤皮肤和酶合剂后，于4-5℃条件下将滤液离心10-15min，随后轻拍轻轻散开沉淀的细胞并用无菌冷PBS重悬，移入新试管，于4-5℃条件下离心10-15min；将沉淀重悬于3-5mL MACS缓冲液中，过滤，于4-5℃条件下离心10-15min，倒出MACS缓冲液，再加入AB血清和静脉免疫球蛋白。

5.根据权利要求1、3或4所述的一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法，其特征在于，所述酶合剂采用以下制备步骤得到：

将胶原酶和透明质酸酶分别过滤消毒后溶解在分离培养基中，每克皮肤添加14-15mg胶原酶，每克皮肤添加6.5-7.5mg透明质酸酶，于37℃水浴中预热整个分离培养基，在添加皮肤匀浆前，每100mL分离培养基中添加100μL无菌DNA酶，制得含酶合剂的培养基；每克皮肤添加10-12mL含酶合剂的培养基。

6.根据权利要求1所述的一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法，其特征在于，步骤一中，添加CD117免疫磁珠并孵育后，加入MACS缓冲液洗涤细胞，于4-5℃条件下离心10-15min，倒出MACS缓冲液，然后将沉淀重悬于MACS缓冲液中，再运行免疫磁珠细胞分选系统，分选出肥大细胞及其他阴性细胞；加入MC培养基，计数MC和阴性细胞，获取纯度和死细胞数量，于4-5℃条件下离心10-15min，倒出上清液，重悬细胞于MC培养基中。