[发明专利]一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法

说明书

本发明一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法，包括以下体系：体外分离培养的肥大细胞、诱导活化肥大细胞和体外组胺检测三个步骤，可定量计算组胺释放量并评估患者的过敏程度、帮助鉴别过敏原。本发明提供的用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法，分离培养的肥大细胞可体外培养最长2个月，大大降低了样本取材和准备时间；诱导肥大细胞释放组胺后，组胺可与微量滴定板上的材料紧密吸附，可予以常温保存和携带，可随意自由安排检测时长和地点，可快速有效鉴别过敏原，无需提取组胺，准备时间短，操作简便，节省检测成本，因此较适合常规诊断及相关临床和科研研究项目，具有广阔的临床和科研应用价值。

技术领域

本发明属于过敏原检测技术领域，具体涉及一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法。

背景技术

随着全球日趋严重的环境污染、化学品滥用、电离辐射、转基因食品、以及各式各样的食品添加剂等以一系列问题的不断出现，“过敏”成为了人类健康的又一大“杀手”。过敏性疾病的治疗是一项系统工程，世界变态反应组织(WHO)推荐“四位一体”的最佳治疗方案，而避免过敏原则是治疗方案的首要原则，因此过敏原检测成为了诊断和治疗过敏性疾病的核心所在。目前过敏原的检测手段分为体内法(点刺试验、班贴试验、皮内试验、变应原激发试验等)和体外法(血清过敏原筛查、组胺释放试验等)。点刺、皮内和变应原激发试验虽是目前临床常用的检测手段，但其过敏原种类有限，且可能导致过敏性休克等严重并发症。班贴试验则主要检测日常接触的化学制品过敏，检测范围受限。血清过敏原检测因其可靠性高、特异性好、敏感度高、安全性最佳成为临床医师最为推荐的检测手段。而体外血清过敏原检测也存在许多问题，其中之一即是“测不准”。虽然现有手段可以精确测量血清中总IgE或部分特异性IgE的含量，但无法对过敏原进行准确诊断：有时临床表现分明提示可能是过敏反应，但检测不到过敏原；而有时临床表现不过敏的物质，过敏原检测却阳性；甚至有时患者对检测出的过敏原从来没有接触过。鉴于过敏的关键步骤是肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化、脱颗粒释放组胺的过程，因此体外组胺释放检测是一种行之有效的体外过敏原检测手段。相对于肥大细胞，嗜碱性粒细胞在人外周血中较易获得的特性，因此，嗜碱性细胞激活实验(Basophil activation test,BAT)是迄今为止目前国际上相关实验室正在使用的体外组胺释放功能检测手段。遗憾的是，BAT检测在不同个体之间的灵敏性和特异性差异较大，BAT检测耗时长，而且依赖于新鲜外周血，又鉴于肥大细胞才是过敏的关键靶细胞，有些过敏患者外周血嗜碱性粒细胞水平较低，部分过敏患者虽然IgE水平较高，但BAT检测结果依然阴性，可能是因为嗜碱性粒细胞也可以通过非IgE介导的通路被激活。因此，目前还没有被纳入常规的临床检测手段，只是应用于部分临床研究。因此，基于体外肥大细胞组胺释放的过敏原检测方法，有望可以有效的克服上述缺陷，达到高效、准确的检测到过敏原的目的。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法。

为实现上述目的，达到上述技术效果，本发明采用的技术方案为：

一种用于过敏原检测的体外肥大细胞组胺释放的检测方法，包括以下步骤：

步骤一、肥大细胞分离

1.去除离体皮肤(均来自整形外科手术切除的多余正常组织)上粘附的脂肪组织，剪成块，移入含中性蛋白酶、Ca²⁺、Mg²⁺的PBS中，4-6℃下孵育过夜；

2.转移到培养皿中，去除表皮；

3.继续剪碎皮肤，将剪碎的皮肤转移到含酶合剂的培养基中，并在摇动的水浴中孵育1-1.5h，将摇动频率设置为250-270Hz，避免粘连；

4.过滤皮肤和酶合剂，并于4-5℃、离心力400g条件下将滤液离心10-15min；