[发明专利]一种溶栓酶的制备及其应用

说明书

本发明公开了一种溶栓酶的制备及其应用，运用具有纤溶活性贝莱斯芽孢杆菌，采用聚合酶链式反应技术扩增提取基因组DNA，所述AprE9912D基因插入到pDE1表达载体中，利用IPTG诱导大肠杆菌表达粗蛋白产物。经制备纯化工艺后，得到溶栓酶，本发明的溶栓酶可以特异性地、高效溶解血栓，迅速恢复栓塞组织的血供，改善栓塞组织的功能，用于血管栓塞性疾病特别是心、脑血管栓塞疾病的防治，作用显著，获得目标产物的效率高，目标产物比目前现有溶栓酶制剂的活性高。

技术领域

本发明涉及溶栓酶领域，具体地说，是涉及一种溶栓酶的制备及其应用。

背景技术

根据流行病学研究，我国心脑血管疾病危险因素的发生率和水平不断呈上升趋势。血栓形成是引起心血管疾病的主要原因，包括动脉血栓、静脉血栓和微循环血栓。血栓性疾病是心脑血管疾病的主要病因，也是导致人死亡或致残的主要因素。寻求溶栓药物用于临床治疗具有重要的医学价值。在血栓性疾病治疗中，纤溶酶具有潜在的应用前景。

目前溶栓药物已发展到第四代，第一代以链激酶(SK)和尿激酶(UK)为代表，特点：溶栓能力强；但缺乏溶栓特异性；并将纤维蛋白原降解，使全身纤溶亢进而导致出血，价格便宜；第二代以组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)为代表，特点：药物与纤维蛋白原亲和力低，不增加全身纤溶亢进，发挥选择性溶栓作用，体内半衰期短，短时间需要大量用药，价格昂贵，有出血风险等问题；第三代利用基因工程技术、蛋白质技术和单克隆抗体技术对第一代和第二代产品进行改造而制成的新型PA产品。此类药物在特异性、半衰期、溶栓效率等方面进行了改进和提高，但目前大多处于实验阶段。因此需要一种能有效解决上述问题的溶栓酶的制备及其应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种溶栓酶的制备及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明包括以下步骤；

A从具有纤溶活性贝莱斯芽孢杆菌9912D提取基因组DNA。

B将所述基因组DNA的AprE9912D基因插入到pDE1表达载体中。

C对所述表达载体进行培养添加IPTG以提高大肠杆菌产生溶栓酶粗制品的能力或效率，然后经提取、分离、纯化获得所述溶栓酶。

进一步地，利用以下引物对来自贝莱斯芽孢杆菌9912D的AprE9912D基因进行扩增：

401：(信号肽开始)

Pro490：(前导肽开始)

722-1：(成熟肽开始)

722-2：

进一步地，所述溶栓酶包括可溶性溶栓酶和不可溶溶栓酶，不可溶溶栓酶需通过复性后才具有纤溶活性，所述溶栓酶与复性剂按照体积比为1∶10-50进行添加。

进一步地，在溶栓酶的上清液加入固体硫酸铵按重量比为1∶1-10进行添加后沉淀分离，沉淀再经溶解、透析和凝胶分离后制取得到纯化溶栓酶制剂。

进一步地，所述溶栓酶在心脑血管疾病的应用。

进一步地，所述溶栓酶可以制备成针剂或口服制剂。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的溶栓酶可以特异性地、高效溶解血栓，迅速恢复栓塞组织的血供，改善栓塞组织的功能，用于血管栓塞性疾病特别是心、脑血管栓塞疾病的防治，作用显著，获得目标产物的效率高，目标产物比目前现有溶栓酶制剂的活性高。

附图说明

图1为溶栓酶的制备中pDE1表达载体中PCR片段插入示意图；