[发明专利]半矮化香蕉基因编辑载体及其构建方法和应用有效

专利信息
申请号: 202010493437.9 申请日: 2020-06-01
公开(公告)号: CN113755520B 公开(公告)日: 2023-06-23
发明(设计)人: 杨乔松;邵秀红;易干军;胡春华 申请(专利权)人: 广东省农业科学院果树研究所
主分类号: C12N15/84 分类号: C12N15/84;C12N15/66;C12N1/21;A01H5/00;A01H6/00;C12R1/01
代理公司: 广州海藻专利代理事务所(普通合伙) 44386 代理人: 张大保
地址: 510000 广东*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 矮化 香蕉 基因 编辑 载体 及其 构建 方法 应用
【说明书】:

发明提供了一种基于CRISPR/Cas9的香蕉GA20ox2基因编辑载体及其构建方法和应用,针对香蕉基因的序列,设计基因编辑靶位点及其引物,以及在构建香蕉GA20ox2基因编辑载体时结合特定的扩增程序,构建得到合理的sgRNA表达框,提供了一种有效且稳定的定向突变香蕉GA20ox2基因的编辑方法,从而使得香蕉GA20ox2基因的表达缺失或减弱。降低了香蕉植株的高度,可以提高香蕉抗倒伏的能力,减轻台风等恶劣天气对香蕉种植园的影响。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域,特别涉及一种半矮化香蕉基因编辑载体及其构建方法和应用。

背景技术

株高是农作物的重要性状之一,合适的株高是保障产量稳定的一个重要因素。香蕉作为重要的经济作物,也是仅位于水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)之后的第四大粮食作物,树体一般超过2米,极易受到高速风,低/高气旋台风的影响,这些台风吹倒了假茎,给商业种植园带来了不可挽回的经济损失。在集约化农业种植条件下,植株矮化可以通过增加抗倒伏能力和降低风雨造成的损害机会对作物农艺产生积极的影响,且矮化的香蕉品种适合密集的田间栽培,促进机械化维护,提高果实收集的效率,并通过减少喷雾漂移允许更精确的农药施用。

作为重要的粮食和经济作物,商业种植的香蕉多为三倍体(AAA)基因组类型,当今种植的Cavendish香蕉实际上是其祖先的遗传复制品,在180多年前被首次繁殖,并且大面积种植的品种,如‘Grand Nain’(Musa acuminata,AAA group,Cavendishsubgroup,大矮蕉),可能是因其理想的农艺性状而被选择的天然克隆变种。然而,三倍体香蕉基本上是不育的,为Cavendish引入新的和有用的特性进行繁殖几乎是不可能的。

申请人曾将株高超过3米的香蕉优良品种‘Gros Michel’( M. acuminata,AAAgroup,又名大蜜舍、大蜜哈等),通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,对水稻 GA20ox2基因在香蕉中的5个同源基因进行定点编辑,获得了具有半矮化表型的‘Gros Michel’香蕉突变株系(Shao et al.,2019)。但该品种不抗香蕉枯萎病菌1号生理小种,即使获得了植株高度极显著下降的新种质,也只能在温室或资源圃中保存,无法进行商业化种植。因此,有必要提供一种植株矮化或半矮化的、且适合商业化种植的香蕉。

发明内容

基于此,本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9的香蕉 GA20ox2基因编辑载体及其构建方法和应用。为实现上述目的,本发明具体技术方案如下:

一种半矮化香蕉基因编辑载体的构建方法,包括以下步骤:

S1. 将核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的接头引物与pYLgRNA-OsU6a质粒混合,同时进行酶切和连接反应,得连接产物;

S2. 由核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.3所示的引物,以S1中所述的连接产物为模板进行PCR扩增反应,得产物A;

由核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5所示的引物,以S1中所述的连接产物为模板进行PCR扩增反应,得产物B;

S3. 将所述产物A与所述产物B混合作为模板,以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7为引物,制备得到gRNA表达盒;

S4. 将所述sgRNA表达盒连接至pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体上。

在其中一些实施例中,所述gRNA表达盒中含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的靶位点。

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