[发明专利]一种新疆虫草菌子实体的人工培育方法

权利要求书

1.一种新疆虫草菌子实体的人工培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1.固体培养基的制备：固体培养基的配方为：葡萄糖20g/L、新鲜马铃薯200g/L 、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、MgSO4·7H₂O 0.07g/L、KH₂PO₄ 0.7g/L、琼脂18g/L；先将固体培养基，121℃蒸汽灭菌20min后，在超净工作台内倒入90mm无菌培养皿中，每皿18mL，冷却备用；同时，将上述培养基，配制于500mL塑料组培瓶中，每瓶150mL，以及100mL玻璃锥形瓶中，每瓶30mL，然后121℃蒸汽灭菌20min后，冷却后备用；

步骤2.在超净工作台中，将野外采集到的新鲜新疆虫草，清除表面泥土和杂物，用含75％乙醇的酒精棉擦洗虫草表面，然后在0.1％氯化汞溶液中消毒4min，无菌水冲洗后，再用灭菌后的滤纸吸干水分，之后，用灭过菌的单面刀片，切去虫草表皮，避开其寄主的消化道，再切取0.2-0.6cm长的新疆虫草菌段，接种于培养皿中的固体培养基上；

步骤3.将培养皿在16-20℃、避光、40-70%RH条件下培养6-15天；此时，在接种的菌段上会有白色的新疆虫草菌菌丝发出；若菌段被杂菌污染，则会显现出杂菌的菌丝形态和颜色；若培养基的空白处有污染，也会显现杂菌菌落；据此，将感染杂菌的培养皿剔除；将未染杂菌的菌段在无菌条件下，转接至500mL塑料组培瓶中；

步骤4.将组培瓶在16-20℃、避光、40-70%RH条件下培养15-70天，让转接的新疆虫草菌在组培瓶的固体培养基上充分生长，直至菌丝长满培养基表面；

步骤5.将组培瓶转移至8-15℃、16L 光照强度200-500Lx :8D、60-90%RH条件下进行冷诱导，诱导培养14-90天，使新疆虫草长出子实体原基；然后，将组培瓶中的子实体原基在无菌条件下，转接至100mL玻璃锥形瓶中；

步骤6.将玻璃锥形瓶中转移至9-16℃、16L 光照强度800-2000Lx :8D、60-90%RH条件下培养30-90天，培养新疆虫草子实体，并使其成熟；

步骤7.在子实体的生长和成熟过程中，颈部逐渐伸长，顶端颜色逐渐加深，由最初的嫩黄色，变为土黄色，直至浅黄褐色，并在表面显现为橘皮样结构，在橘皮样结构表面有与周围颜色不一致的散点状均匀分布的子囊壳口孔；

步骤8.此时，将子实体顶端结构取出一部分，转接至新的固体培养基上，在16℃、16L光照强度1200Lx:8D、自然相对湿度条件下培养10天后，发现子实体周边会显现出很多小的菌落，实为成熟的子实体上子囊壳经由子囊壳口孔释放的子囊孢子所形成；随着培养的继续，菌落在子实体附近逐渐生长连接为一体，周边依然能看到由释放的子囊孢子形成的散点状菌落；

再次取出前述人工培育的部分子实体，随后取出由人工培育的子实体释放的孢子所形成的散点状菌落，分别进行分子鉴定，鉴定结果显示所测得的整体ITS序列均如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的新疆虫草菌子实体的人工培育方法，其特征在于，步骤3中，将培养皿在18℃、避光、40-70%RH条件下培养6天。

3.根据权利要求1所述的新疆虫草菌子实体的人工培育方法，其特征在于，步骤4中，将组培瓶在180℃、避光、40-70%RH条件下培养15天。

4.根据权利要求1所述的新疆虫草菌子实体的人工培育方法，其特征在于，步骤5中，将组培瓶转移至12℃、16L、光照强度300Lx:8D、60-90%RH条件下进行冷诱导，诱导培养14天。

5.根据权利要求1所述的新疆虫草菌子实体的人工培育方法，其特征在于，步骤6中，将玻璃锥形瓶中转移至14℃、16L、光照强度1200Lx:8D、60-90%RH条件下培养30天。