[发明专利]用于提取金黄色葡萄球菌总蛋白的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及金黄色葡萄球菌检测，具体涉及一种用于提取金黄色葡萄球菌总蛋白的方法及试剂盒。所述方法包括：培养金黄色葡萄球菌并收集菌体，用反应缓冲液重悬菌体，然后加入由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶，于37℃温育30‑60min，得到酶解产物；用PBS溶液稀释所述酶解产物，即得金黄色葡萄球菌总蛋白提取物。该方法具有简便快捷、蛋白提取效率高的优点，解决了金黄色葡萄球菌全蛋白难提取的问题。

技术领域

本发明涉及金黄色葡萄球菌检测，具体涉及一种用于提取金黄色葡萄球菌总蛋白的方法及试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)也称“金葡菌”，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物；金黄色葡萄球菌对高温有一定的耐受能力，在80℃以上的高温环境下30min才可以将其彻底杀死，另外金黄色葡萄球菌可以存活于高盐环境，最高可以耐受15％浓度的NaCl溶液；金黄色葡萄球菌的细胞壁耐受性非常高，常规物理机械方法和去垢剂等方法破碎其细胞壁释放胞内核酸、蛋白都较为困难，这些都影响了现代分子生物学检测方法在金黄色葡萄球菌低浓度快速检测中的应用。

溶葡球菌酶(Lysostaphin)，又称为溶葡素，可裂解金黄色葡萄球菌。目前通常采用大肠杆菌或毕赤酵母菌表达溶葡球菌酶，但制备的溶葡球菌酶活性较低，无法单独用于金黄色葡萄球菌的破壁，需要与溶菌酶联用或者借助物理的菌体破壁方法才能裂解金黄色葡萄球菌，导致操作步骤十分繁琐，耗费时间长。

当前对于金黄色葡萄球菌的检测主要是培养基生化法，以DNA为检测靶的PCR方法和以菌体表面蛋白为检测靶的免疫学方法都因为方法学的限制没能得到广泛应用，其障碍主要在于：金黄色葡萄球菌的细胞壁对于蛋白酶、去垢剂和高盐渗透的耐受能力高，在破壁阶段耗时且效率不高，难于提取到完整且有相当数量的DNA；总蛋白提取过程中，采用超声波、冻溶等方法破碎细胞获取全蛋白异常困难，往往妥协检测细胞表面蛋白而避免破壁，但金黄色葡萄球菌外膜蛋白proteinA可以特异性的与抗体蛋白结合，削弱免疫检测的效果，造成假阴性。

发明内容

为了解决金黄色葡萄球菌全蛋白难提取的问题，本发明提供用于金黄色葡萄球菌总蛋白提取的方法和试剂盒，具有简便快捷、蛋白提取效率高的优点。

一方面，本发明提供一种金黄色葡萄球菌总蛋白提取方法，包括：培养金黄色葡萄球菌并收集菌体，其特征在于：用反应缓冲液重悬菌体，然后加入由酿酒酵母菌表达的溶葡球菌酶，于37℃温育30-60min，得到酶解产物；用PBS溶液稀释所述酶解产物，即得金黄色葡萄球菌总蛋白提取物。

在本发明所述方法的优选实施例中，所述溶葡球菌酶的制备方法包括如下步骤：在溶葡球菌酶的氨基酸序列的N端添加可溶序列，C端添加酶蛋白稳定性序列，得到重组溶葡球菌酶的氨基酸序列；合成所述重组溶葡球菌酶的编码基因并构建表达载体，然后转化酿酒酵母菌，得到重组酿酒酵母菌；培养重组酿酒酵母菌，诱导蛋白表达并进行蛋白纯化。

在本发明所述方法的优选实施例中，所述溶葡球菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述可溶序列如SEQ ID NO:3所示，所述酶蛋白稳定性序列如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述重组溶葡球菌酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明所述方法的优选实施例中，所述反应缓冲液包含如下组分：15-30mM pH7.0-8.0Tris-Cl，0.5％-1.2％g/ml NaCl，5-15mM EDTA，2-8mM MnCl₂，0.05％-0.12％g/mlSDS。

在本发明所述方法的优选实施例中，所述反应缓冲液的配方为：20mM pH7.4Tris-Cl，0.9％g/ml NaCl，10mM EDTA，5mM MnCl₂，0.1％g/ml SDS。