[发明专利]一种树脂固定化海洋环糊精葡萄糖基转移酶的方法

说明书

本发明涉及一种树脂固定化海洋环糊精葡萄糖基转移酶的方法，属于生物技术领域，所述方法具体如下：称取活化好的树脂MI‑BSI，加入浓度为0.067mg/mL的CGTase酶液中，酶液由pH 9的甘氨酸‑氢氧化钠缓冲液配制，活化好的树脂MI‑BSI与CGTase酶液的质量体积比为10:1(mg/ml),在35℃，200rpm的摇床中固定化8小时。本发明采用吸附和共价结合法的固定化技术，反应条件温和，操作简单，成本较低，固定化环糊精葡萄糖基转移酶热稳定性优于游离酶，pH稳定性优于游离酶，对酸和碱的耐受性增强，固定化酶重复使用性好，重复使用10次，其相对酶活保留率在65％以上。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种树脂固定化海洋环糊精葡萄糖基转移酶的方法。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase,CGTase，EC2.4.1.19)属于α-淀粉酶第13号家族的重要成员，能够催化四种反应，分别是水解反应、环化反应、耦合反应和歧化反应。在这四种反应中，环化反应、歧化反应、耦合反应是转糖基作用，活性较高，水解反应活性较低，并且控制水解活性将有利于环糊精的生产，其中，环化反应是生产环糊精的特征反应，作为一种生物催化剂，CGTase在工业上主要用来催化淀粉转化为环糊精。环糊精(CD)主要包括α-CD，β-CD，γ-CD。它是一种筒形结构的分子，基于其内部疏水、外部亲水的这种特殊的结构，使得环糊精及其衍生物在食品工业、生物技术、医药行业、化妆品、化学工业以及其它方面也有很大的应用前景。因此，生产环糊精所需的CGTase的相关研究也越来越多。

固定化酶是二十世纪六十年代发展起来的一项新技术。固定化酶即酶的定位和限制,是指将游离酶与载体结合，使游离酶被束缚或限制在一定区域内，不能自由移动，但仍能进行其特有的催化反应。酶被固定化后，易于从产物和底物中分离出来,能够有效的回收和重复使用，相比于游离酶，固定化酶的热稳定性和操作稳定性均增强。传统的固定化方法主要有吸附法、包埋法、交联法、共价结合法等，吸附法中酶与载体结合力不强，酶分子易脱离载体；包埋法中酶液易流失，不易于催化大分子底物；交联法一般与其他方法结合使用；共价结合法中酶与载体结合牢固，但固定化条件激烈，酶活力会受到影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以共价结合法固定化海洋环糊精葡萄糖基转移酶的方法，该方法具有操作简单，成本低，固定化酶稳定性好，可重复使用等特点。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种树脂固定化海洋环糊精葡萄糖基转移酶的方法，所述方法具体如下：

(1)载体活化选择氨基功能树脂MI-BSI作为载体，载体在固定化前经以下步骤处理进行活化：载体加入0.1M pH 8.0的PBS缓冲液浸泡清洗1h后过滤抽干，载体与PBS缓冲液的质量体积比为1:4(g/ml),再加入等体积的加入含有2％戊二醛的0.1M pH 8.0PBS缓冲液,25℃缓慢搅拌1h后过滤，用去离子水洗涤载体3-5次，冻干，得到活化的载体；

(2)固定化准确称取活化好的树脂MI-BSI，加入浓度为0.067mg/mL的CGTase酶液中，酶液由pH 9的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制，活化好的树脂MI-BSI与CGTase酶液的质量体积比为10:1(mg/ml),在35℃，200rpm的摇床中固定化8小时。

所述海洋微生物环糊精葡萄糖基转移酶由黄海水产研究所海洋产物资源与酶工室实验室制备。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1.本发明提供的氨基功能树脂具有氨基官能团等优点，被广泛应用于生物技术领域的研究。

2.本发明采用吸附和共价结合法的固定化技术，反应条件温和，操作简单，成本较低