[发明专利]一种能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。本发明提供的试剂盒在胶体金二联卡的分析膜上同时设置检测非洲猪瘟病毒抗原和抗体的检测线，并优选非洲猪瘟病毒P30蛋白做抗体的检测，非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体做抗原的检测，配合使用配套的样品稀释液，可以一步法操作同时检测猪全血中非洲猪瘟病毒P30蛋白抗体和P72蛋白抗原。

技术领域

本发明属于生物技术领域中的抗原和抗体检测领域，具体涉及一种能够同步检测猪血中 非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒及检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(Africa swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africa swine fevervirus，ASFV) 引起的家猪和野猪的一种急性、热性和高传染性的疾病。自1921年首次发现非洲猪瘟疫情， 该病已在全球数十个国家流行。经基因进化树分析发现该毒株属于基因II型，与Georgia 2007/1毒株属于一个进化分支。

目前尚无有效的疫苗来预防非洲猪瘟病毒，只能通过“检疫-淘汰”的模式进行生物防护。 现有对非洲猪瘟的检测分两种，一种是病原检测；另外一种是抗体检测。

病原的检测有两种方法，一种是分子生物学的方法，检测病毒的核酸；另外一种是免疫 学方法，检测病毒的蛋白抗原。分子生物学方法主要是各种PCR的方法，包括荧光PCR、等 温介导的PCR等模式。PCR的方法灵敏度高，特异性好，但是需要专门的仪器(各种PCR仪)、专业的实验人员以及专门的实验室。有时会因为气溶胶的污染导致全部待测样品假阳性结果的出现。免疫学的方法主要是指基于抗原抗体反应的胶体金方法，该法灵敏度低于PCR 方法，但是对于人员、操作环境和仪器设备都没有要求，特别适合于现场或基层使用，尤其 是不具备实验条件的单位。因此，免疫学方法和分子生物学方法各自有适合的使用环境。

非洲猪瘟病毒抗体的检测只能采用免疫学方法实现，不能用分子生物学方法。抗体是抗 原免疫后或者病毒感染后的产物，一般3-7天开始产生，30天前后达到峰值。感染非洲猪瘟 病毒的猪也会产生抗体。感染非洲猪瘟病毒而没有死亡，能够存活下来的猪，人们称之为“耐 过猪”。这种耐过猪检测病原包括各种PCR方法检测非洲猪瘟病毒核酸或胶体金检测病毒蛋 白，一般都为阴性，但是检测抗体却会呈现阳性。现有研究(P.L.Eblé等，Transmission of African Swine Fever Virus via carrier(survivor)pigs doesoccur，Veterinary Microbiology，2019年10月 第237期)表明临床健康的带毒康复猪(“耐过猪”)也可以引发非瘟急性感染，造成非瘟 病毒在猪群中持续存在。这种耐过猪也应该逐步淘汰，避免进一步散毒的风险。因此，有研 究者建议猪场应该筛选“双阴性”的猪保留和养殖，所谓双阴性指的是病原和抗体同时阴性。 临床常用的抗体检测方法是胶体金抗体试纸条或ELISA试剂盒，如前所述，各自有自己适合 的使用环境。非洲猪瘟抗体ELISA试剂盒适合相对专业的实验室；胶体金方法更适合现场和 基层使用。

非洲猪瘟病毒是一种烈性、高度接触性的传染病，减少猪间的交叉感染是防护的重要手 段。如果一次采血，同时检测非洲猪瘟病原和非洲猪瘟抗体，对于非洲猪瘟的预防将有重大 的帮助意义。但是，目前还未见能够同时检测非洲猪瘟病毒病原(核酸或蛋白抗原)和非洲 猪瘟病毒抗体的产品。另外，传统方法检测抗体都是检测血清中的抗体，需要采血、分离血 清，容易形成气溶胶，增加了生物风险。另一方面，不能直接检测全血，还需配备血清分离 装备，现场检测操作不方便。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种能够同步检测猪 血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒，其包括：

胶体金二联卡，其由胶体金试纸条制成，其中所述胶体金试纸条的分析膜上设置有两条 检测线T1和T2以及一条质控线C，在所述胶体金二联卡上对应于检测线和质控线的位置设 置有观察窗，在对应于胶体金试纸条的样品垫的位置开设加样孔；