[发明专利]产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株及构建方法

权利要求书

1.一种产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株通过将金霉素产生菌中的参与金霉素合成C6位甲基化相关基因采用基因工程方法进行突变得到；所述金霉素合成C6位甲基化相关基因为甲基转移酶ctcK基因。

2.根据权利要求1所述的产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株，其特征在于，所述突变包括去除或取代。

3.根据权利要求1所述的产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株，其特征在于，所述取代具体为：将甲基转移酶ctcK基因取代为壮观霉素抗性基因。

4.根据权利要求1所述的产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为金黄色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)F3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2013080。

5.一种根据权利要求1所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、构建包含完整CTC合成基因簇的柯斯质粒17G4；

B、将柯斯质粒17G4通过大肠杆菌中表达的λ-Red重组酶系统进行基因重组，使其中的甲基转移酶基因ctcK突变，得到柯斯质粒pYWN-K；

C、将柯斯质粒pYWN-K转入金霉素产生菌中，进行DNA同源重组，即得所述的基因工程菌株。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤A中，所述柯斯质粒17G4的具体构建方法为：利用CopyControl^TMFosmid Library Production试剂盒构建Streptomyces aureofaciens F3基因组文库，并根据氯代酶基因设计探针，筛选基因组文库，即获得包含完整金霉素生物合成基因簇的柯斯质粒17G4。

7.根据权利要求5所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤B中，所述将柯斯质粒17G4通过大肠杆菌中表达的λ-Red重组酶系统进行基因重组的具体步骤如下：

B1、以质粒pIJ778为模板，用引物KTAR-P1和KTAR-P2 PCR扩增具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段，其上、下游各包含39bp的同源臂；

B2、通过电转化将柯斯质粒17G4导入大肠杆菌E.coli BW25113/pKD46感受态细胞中，得到E.coli BW25113/17G4电转化感受态细胞；

B3、将步骤B1获得的具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段电转入包含柯斯质粒17G4的E.coli BW25113/17G4电转化感受态细胞中，并在其中表达的λ-Red重组酶介导下，具有转移起始位点oriT的壮观霉素抗性基因片段与柯斯质粒17G4发生同源重组，将17G4上的ctcK基因片段替换为具有转移起始位点ori T的壮观霉素抗性基因片段。

8.根据权利要求5所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤C中，所述将柯斯质粒pYWN-K转入金霉素产生菌中的具体步骤如下：

C1、将柯斯质粒pYWN-K转化携带质粒pUZ8002的大肠杆菌，然后在氯霉素、壮观霉素和卡那霉素存在下过夜培养，再转接培养后，收集并洗涤菌体；

C2、将金霉素生产菌孢子进行热激和预萌发处理后，与步骤C1获得的菌体等量混合，然后接种到培养基上培养，进行细菌双亲接合转移；

C3、培养一定时间后，用含萘啶酮酸和壮观霉素的无菌水覆盖培养基，培养7～10天后，得到转移接合子，即为所述的基因工程菌株。

9.根据权利要求5或8所述的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述金霉素生产菌为金黄色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)F3，保藏编号为：CCTCC NO：M 2013080。

10.一种根据权利要求1所述的基因工程菌株生产去甲基金霉素和去甲基四环素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将基因工程菌株接种到含有壮观霉素的燕麦平板上，培养5-8天后，接种至10.3％TSBY培养基中摇床培养，再接种到发酵培养基中摇床培养4-5天，即得。